使用表达LGR4、LGR5和LGR6的上皮干细胞在组织应用中开发和使用最小极性化功能细胞微聚集体单元的方法技术

本文提供的是微聚集体多细胞、最小极性化移植物的构建体，其含有表达含有富含亮氨酸重复序列的G‑蛋白偶联受体(LGR)的细胞，用于伤口治疗应用、组织工程学、细胞疗法应用、再生医学应用、医学/治疗应用、组织愈合应用、免疫疗法应用和组织移植疗法应用，其优选与递送载体/基底/支持物/支架联合以用于直接施用。

Development and application of minimal polarity functional cell micro aggregates unit using epithelial stem cells expressing LGR4, LGR5 and LGR6 in tissue engineering

This paper provides a construct of graft micro aggregates, multicellular polarity which contains the smallest, the expression of G protein coupled receptor containing leucine rich repeats (LGR) cells for wound therapy, tissue engineering, cell therapy and regenerative medicine / treatment application, medical application, tissue healing and immune application therapy and tissue transplantation therapy, preferably with delivery / substrate / support / support joint for direct application.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用表达LGR4、LGR5和LGR6的上皮干细胞在组织应用中开发和使用最小极性化功能细胞微聚集体单元的方法优先权声明本PCT国际申请要求2015年11月30日提交的美国系列号14/954335的优先权，其本身要求2014年12月2日提交的美国临时申请系列号62/086,526的权益，所述申请通过引用结合到本文中。
本专利技术涉及含有表达含有富含亮氨酸重复序列的G-蛋白偶联受体(LGR)的细胞的微聚集体多细胞移植物的构建体，用于伤口治疗应用、组织工程学、细胞疗法应用、再生医学应用、医学/治疗应用、组织愈合应用、免疫疗法应用和组织移植疗法应用。更具体而言，本专利技术提供用于直接施用的在递送载体/基底/支持物/支架上的可递送微聚集体多细胞LGR构建体。背景多年以来，临床医生和研究人员在寻找这样的抗微生物剂，其不仅减轻微生物伤口负荷，还具有更小的细胞毒性副作用。从烧伤到急性和慢性伤口二者，存在操作天然存在的源于自身的抗微生物肽的可能性，因为这些物质通常通过膜透化作用起作用，其为较不可能导致微生物耐药性的机制。随着伤口中感染的持续风险以及对现有抗生素疗法的细菌耐药性的渐进流行，对开发用于皮肤烧伤和创伤的新一类局部抗微生物剂存在真正需求。基本上存在伤口愈合的四个阶段，其在过去的一个世纪里进行阐述：(1)止血阶段，(2)炎症阶段，(3)增生阶段和(4)重塑阶段。这些连续阶段首先通过迁移到伤口中的细胞类型来定义，并随后通过在组织内表达的细胞因子和生长因子的类型来定义。随着在间充质细胞和脂肪来源的干细胞分离和移植方面的最新进展，研究人员已开始研究这些细胞如何在各阶段改进愈合并改变表达，特别是贯穿晚期炎症阶段至重塑阶段。非常类似于较深层区室的间充质细胞和脂肪来源的干细胞，上皮干细胞从原始外胚层形成，其随后形成更表面的上皮区室，并因此在皮肤伤口愈合中亦具有潜在作用。目前对于移植和施用分离的表达LGR4、LGR5和LGR6的上皮干细胞如何改变伤口愈合基因表达，只有有限的研究。已知的是，在对皮肤的严重全厚度损伤之后，表达LGR4、LGR5和LGR6的上皮干细胞群体常常被破坏，使组织不能产生可存活且自我维持的上皮区室。尽管有通过局部炎症和后续的一系列细胞实体的趋化作用驱动的肉芽组织形成(granulatory)和纤维变性作用的组合，在没有上皮干细胞局灶龛(focalniche)的情况下，剩余组织不具有形成功能上皮、毛囊、汗腺等的再生潜能。对人和哺乳动物组织的复合性全厚度损伤和/或涉及多个组织成分(皮肤、肌肉、脂肪、血管、神经和骨)的复合性损伤，本质上难以愈合。通过当前伤口护理方法、使有当前获准技术的手术干预(利用细胞、组织、装置、生物制品、药物和/或生长因子)，治疗所述损伤和后续所致的伤口亦很困难。所述困难的一个常见原因为，保留在受伤或受损组织床之中或周围的组织通常缺乏相互依赖的必需组分：1)祖细胞和/或干细胞群体；2)胞外基质/支架成分和基底；和3)细胞实体和基底之间的相互作用的组合。细胞龛、ECM(胞外基质)支架和相关交互界面的这种缺乏，随后导致不能再生或生成细胞迁移、分化和组织极性化所需的基本多维结构。在没有这些细胞与细胞和细胞与基质相互作用的情况下，伤口床内的剩余细胞实体(不论其增殖或谱系潜能)被迫主要提供屏障效用，而不是形成能够进行可识别“功能”的更复杂的多组织构建体。因此，不论是否涉及皮肤、肌肉、脂肪、腱、骨，伤口均随后变为有瘢痕、杂乱且机能失调的。在培养皮肤、软骨、骨、肌肉、血管、神经、淋巴和相关替代物的组织工程学领域的当前应用，主要基于三部分策略：1)获得组织来源并从所述组织收获细胞悬液；2)将这些细胞施用至基质或支架；和3)将构建体移植到人或动物的靶部位之上或之中。然而，在缺乏上文确定的相互依赖的必需组分的情况下，组织工程学应用、细胞疗法应用、再生医学应用、组织愈合应用和组织移植疗法应用不具有有能力装配功能极性化组织所需的天然细胞微聚集体结构。因此，因缺乏适当的相互依赖、祖细胞群和适当的支架所致，阻止了所述构建体用于诸如多区室组织再生和/或骨和肌肉重建等治疗性应用。因此，部分因前述原因所致，产业界和学术界二者将大量努力和资源引导至开发合成组织替代物、自体移植构建体以及患者来源的表皮扩张自体移植物(即来自CambridgeMA的VericelCorporation的Epicel®)。尽管这些产品有益，但常常很昂贵，且不能给患者提供真正的多区室组织构建体。例如，培养的上皮自体移植物(CEA)仍不能修复在天然皮肤中见到的上皮和真皮区室二者。但是鉴于缺少相互依赖的功能性区室，培养细胞不具有形成真正定义皮肤的体被(表皮、真皮、腺体和毛发)所需的扩展的局部干细胞群和逐渐发展的组织极性化。该缺乏继而导致单细胞层脆性、上皮不稳定性、屏障破坏和瘢痕。备选地，诸如来自LifeCellCorporation的Alloderm®、来自IntegraLifeSciencesCorporation的Integra®和来自MusculoskeletalTransplantFoundation的产品DermaMatrix等更稳健的非细胞基质，尽管是优秀的重建选项，但缺乏形成功能天然组织所必需的适当安置的谱系特异性干细胞群。本专利技术人已记述了关于LGR5和LGR6作为哺乳动物中的肠和上皮干细胞两者的标志物的相对较新的认识。在用肠来源的人α防御素5刺激毛囊隆突LGR5+和LGR6+干细胞导致减少的细菌存在，增强的伤口愈合以及从缺乏附属结构的组织中的毛发生长(StimulationoftheFollicularBulgeLGR5+andLGR6+StemCellswiththeGut-DerivedHumanAlphaDefensin5ResultsinDecreasedBacterialPresence,EnhancedWoundHealing,andHairGrowthfromTissuesDevoidofAdnexalStructures)，Plast.Reconstr.Surg.132:1159，2013中，含有富含亮氨酸重复序列的G-蛋白偶联受体(LGR)为与促卵泡激素、促甲状腺激素和促黄体生成素受体家族具有显著序列和结构同源性的七次跨膜蛋白受体。在该研究中，认识的是，与人β防御素1和磺胺嘧啶相比，人α防御素5肽显著增强伤口愈合并减少基础细菌负荷。人α防御素5为诱导LGR干细胞迁移到伤口床中的唯一疗法。此外，基因热图显示关键伤口愈合和Wnt途径转录物(例如Wnt1和Wisp1等)的显著的mRNA上调。因此推断通过增加关键的Wnt和伤口愈合转录物，人α防御素5可用于增进伤口愈合，因为观察到增加的LGR干细胞迁移到伤口床中以及相关细菌减少和毛发产生。简单说来，该工作及其它工作使得认识到在直接生物医学工程软组织构建体中使用表达LGR4+、LGR5+和LGR6+的上皮干细胞的可能性。专利技术概述在第一个实施方案中，本专利技术提供一种最小极性化的微聚集体多细胞组合物，其包含分离的表达LGR的活细胞和选自支架、胶原、基质、颗粒和纤维的多维支持物。在前述实施方案的进一步实施方案中，本专利技术提供一种最小极性化的微聚集体多细胞组合物，其包含分离的表达LG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种最小极性化的微聚集体多细胞组合物，特征在于：一种选自支架、胶原、基质、颗粒和纤维的多维支持物，和分离的表达LGR的活细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.02 US 62/086526;2015.11.30 US 14/9543351.一种最小极性化的微聚集体多细胞组合物，特征在于：一种选自支架、胶原、基质、颗粒和纤维的多维支持物，和分离的表达LGR的活细胞。2.权利要求1的组合物，进一步特征在于包含生长因子和表达LGR的细胞选自LGR4、LGR5和LGR6。3.权利要求1的组合物，进一步特征在于包含迁移/募集分析物和表达LGR的细胞选自LGR4、LGR5和LGR6。4.根据权利要求1-3中任一项的组合物，进一步特征在于包含选自配体家族、R-脊椎蛋白、EDGF、PDGF、Wnt、VEGF和抗微生物肽的LGR特异性结合成分，且其中表达LGR的细胞选自LGR4、LGR5和LGR6。5.根据权利要求1-3中任一项的组合物，进一步特征在于将所述组合物用于治疗性构建体，所述构建体用于组织区域、伤口、空隙、缺损组织或血液中的任一种。6.根据权利要求1-3中任一项的组合物，进一步特征在于将所述组合物用作改变周围邻近组织的治疗性构建体。7.根据权利要求1-3中任一项的组合物，进一步特征在于所述多维支持物和分离的表达LGR的活细胞提供用于加速伤口愈合的微聚集体多细胞构建体。8.根据权利要求1-3中任一项的组合物，进一步特征在于所述多维支持物和分离的表达LGR的活细胞提供用于在身体各处的组织系统修复或恢复的微聚集体多细胞构建体。9.一种组织移植物，其包含根据权利要求1-3中任一项的组合物，用于在哺乳动物身体各处施用于外胚层、中胚层或内胚层来源的组织系统。10.一种用于获得最小极性化的微聚集体多细胞组合物的方法，特征在于生长和分离表达LGR的活细胞以移植到所选哺乳动物靶组织的步骤。11.根据权利要求10的用于获得最小极性化的微聚集体多细胞组合物的方法，进一步特征在于使所述分离的表达LGR的活细胞附着于选自支架、胶原、基质、颗粒和纤维的多维支持物上的步骤。12.根据权利要求10的用于获得最小极性化的微聚集体多细胞组合物的方法，进一步特征在于从LGR4、LGR5和LGR6中选择表达LGR的细胞的步骤。13.根据权利要求12的用于获得最小极性化的微聚集体多细胞组合物的方法，进一步特征在于将所述最小极性化的微聚集体多细胞组合物直接施用于体内组织以进行组织修复的步骤。14.根据权利要求12的用于获得最小极性化的微聚集体多细胞组合物的方法，进一步特征在于将所述最小极性化的微聚集体多细胞组合物经由血流间接施用于身体以进行组织修复的步骤。15.根据权利要求12的用于获得最小极性化的微聚集体多细胞组合物的方法，进一步特征在于将所述最小极性化的微聚集体多细胞组合物施用于上皮系统、腺体、毛发、神经、骨、肌肉、脂肪、腱、血管、筋膜、眼组织和肽分泌性细胞成分之一的步骤，其采用通过选自以下的技术来递送：施用、移植、植入、定向接种、定向迁移、定向追踪、沉淀、层压和/或注射所述细胞成分，用于产生、再生、增强和愈...

【专利技术属性】
技术研发人员：DM洛，
申请(专利权)人：两极组织工程公司，
类型：发明
国别省市：美国,US