全长FRO**基因的克隆和构建制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域的一种全长ＦＲＯ↓［２］基因的克隆和构建。主要特征是在对合成的ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增步骤时，根据拟南芥的抗缺铁基因的基因序列以及ＰＲＩＭＥＲ３软件设计引物，该引物包括全长的基因两端带有酶切位点的两个引物以及根据基因内部保守序列设计的两对巢式引物并建立ＰＣＲ反应。本发明专利技术提出了高质量的总ＲＮＡ的提取方法和高质量的ｃＤＮＡ的合成以及两轮多重巢式ＰＣＲ技术和ＰＣＲ反应条件的优化技术，实现在国内首次高效、方便、快速地克隆和构建限速酶基因Ｆｅ↑［３＋］－螯合物还原酶基因－ＦＲＯ↓［２］基因，并将影响植株铁素吸收和代谢的全长ＦＲＯ↓［２］导入苹果并建立了苹果的高效农杆菌介导的转化体系。

【技术实现步骤摘要】
所属领域本专利技术属于农业生物
或植物基因工程领域，尤其是一种全长FRO2基因的克隆和构建。
技术介绍
果树具有多年生、童期长、自交不亲和、杂合程度高、多无性繁殖等特点，使采用基因转移技术获得转基因植物新品种逐渐成为果树育种的重要手段。最早是1988年以核桃体系为外植体，通过农杆菌介导，获得了转基因植株。而后又在许多果树上进行了研究，如在核桃上又相继导入了ICP基因和CHS基因，猕猴桃上已转入水稻的homebox基因，Sagi等在香蕉中转入控制开花的基因，Gervera等在柑橘中转入了耐盐基因HAL2，并已得到再生植株，Bell等在梨中转入了rolC基因。1996年Eide等人从拟南芥中克隆到第一个高等植物的Fe2+转移蛋白基因-IRT1(Iron Regulated Transporter)。IRT1在酵母中的表达能使因缺乏铁吸收能力的酵母双突变体fet3fed4的受缺铁限制的生长恢复。但至今还未见到有人将此基因导入高等植物植株的报道。双子叶植物吸收研究的另一重大进展是1999年，Robinson等人首次从拟南芥中分离到了Fe3+-螯合物还原酶的基因-FRO2(Ferric-Chelate Reductase)基因。FRO2基因是等位基因，在缺铁胁迫的拟南芥根部表达，属于一个跨膜转运电子的b-型细胞色素大家族。在缺铁胁迫下，Fe3+-螯合物还原酶的合成增加，使该酶活性增强。FRO2基因的导入使缺失FRO2基因的突变体的黄化症状消失，FRO2比Fre1和FRO1有更强的活性。Mori小组1999年将从酵母菌中分离的Fe3+还原酶基因-Fre1基因，构建成为Refrel基因后导入烟草，转基因植株表达了全长的mRNA，而且在正常供铁的条件下检测到了组成型的Fe3+-还原酶活性。Samuelson等人从酵母上获得了Fe3+-螯合物还原酶的基因--Fre2，转入烟草后获得高表达的转基因植株，与对照相比、转基因株对铁的吸收力提高了4倍。因此，FRO2基因对于果树的转化十分重要，快速、高效、方便地培养FRO2基因是一个十分重要的课题。目前所使用的基因克隆技术是RT-PCR扩增基因。该方法存在许多缺点1.当组织中所扩增的基因的mRNA含量较低时，很难扩增出全长的FRO2基因；2.当基因较大时，扩增全长的FRO2基因非常困难，需要高质量的RNA和cDNA和非常苛刻的PCR反应条件，因此难以实现；3.PCR反应条件的优化很复杂，无一个定式，通常要花大量的财力和时间；4.在基因构建时，采用何种方法和策略是构建成功的关键，目前还没有一个十分科学有效的方法；5.现有基因的克隆和构建十分繁复，效率低下，时间漫长，不利于现场推广以及以后的产业化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种全长FRO2基因的克隆和构建的科学方法，该方法可以高效、方便、快速地克隆和构建全长FRO2基因。本专利技术的目的是这样实现的全长FRO2基因的克隆和构建，其克隆的步骤为(1)拟南芥植株中RNA的提取；(2)通过该RNA的反转录cDNA的合成；(3)对合成的cDNA的PCR扩增；(4)全长FRO2-PCR扩增基因的分离和纯化；(5)全长FRO2-PCR扩增基因的克隆；(6)全长FRO2-PCR扩增基因转化大肠杆菌；(7)全长FRO2基因克隆的筛选；(8)全长FRO2克隆基因的酶切鉴定；(9)全长FRO2基因序列的确认；其构建的步骤为(1)带特异性粘性末端的全长FRO2基因的大量富积；(2)带有特异性粘性末端的质粒pCB302-3的大量富积；(3)FRO2/pCB302-3质粒的构建；其特征在于在对合成的cDNA的PCR扩增步骤时，根据拟南芥的抗缺铁基因的基因序列以及PRIMER3软件设计引物，该引物包括全长的基因两端带有酶切位点的两个引物以及根据基因内部保守序列设计的两对巢式引物，共三对引物；这三对引物建立如下PCR反应H2O25微升 引物10.2-0.5微升cDNA1-3微升引物20.2-0.5微升 10XBuffer0.5微升巢CH10.2-0.5微升dNTP 0.2-0.8微升巢CH20.2-0.5微升Taq酶0.1-0.3微升巢CH30.2-0.5微升Mg+ 1-5微升巢CH40.2-0.5微升上述反应的反应条件1X 95℃ 3-6分钟28-40X 95℃ 20-30秒45-70℃2-4分钟72-76℃1-3分钟1X 72℃ 10分钟1X 4℃∞而且，引物1、引物2为两端带有酶切位点的一对引物，巢CH1、巢CH2、巢CH3、巢CH4为两对巢式引物。而且，用两对巢式引物进行第一轮PCR反应，再以纯化后的第一轮反应的产物为模板进行第二轮PCR反应。而且，PCR扩增反应中一对引物、两对巢式引物同时进行，以快速得到全长的FRO2-PCR扩增基因。本专利技术的优点和积极效果是1.在国内首次高效、方便、快速地克隆和构建影响植株铁素吸收和代谢的关键性限速酶基因Fe3+-螯合物还原酶基因-FRO2基因，克隆和构建FRO2基因的方法科学合理。2.提出了高质量的总RNA的提取方法和高质量的cDNA的合成以及两轮多重巢式PCR技术和PCR反应条件的优化技术。4.在国际首次将影响植株铁素吸收和代谢的关键性限速酶基因Fe3+-螯合物还原酶基因--FRO2导入苹果，并首次建立了苹果的高效农杆菌介导的转化体系。具体实施例方式下面对本专利技术实施例做进一步详述本专利技术所述的FRO2基因的克隆和构建包括两大步骤，其一为克隆，其二为构建，其详细的步骤如下 一、FRO2基因的克隆1.RNA的提取(1)将拟南芥的植株根系取样、清洗并在液氮下磨成粉末形成基因样品；(2)将该基因样品放入预热的BUFFER中，采用苯酚氯仿提取2次，取上清液，加LiCl，孵化过夜；(3)用乙醇清洗沉淀三次，然后真空干燥；(4)溶解该沉淀于去离子水中，加NaAce和乙醇沉淀过夜；(5)离心去上清液，溶解该沉淀于去离子水中，形成RNA溶液。这种RNA的提取方式可以保证所提取的RNA的高质量的和高浓度，是合成高质量的cDNA的前提。2.cDNA的合成(1)将RNA溶液和引物OligoDT放入离心管中，在70℃下反应5分钟，然后冰上冷却；(2)加dNTP、RT酶、BUFFER和水，在42℃下反应60分钟，冰上冷却；(3)在85℃反应5分钟，合成高质量和高浓度的cDNA。3.进行PCR扩增根据拟南芥的抗缺铁基因的基因序列以及PRIMER3软件设计引物，该引物包括全长的基因两端带有酶切位点的引物(引物1、引物2)以及根据基因内部保守序列设计的两对巢式引物(巢CH1、巢CH2、巢CH3、巢CH4)共三对引物。这三对引物建立如下PCR反应H2O25微升 引物10.2-0.5微升cDNA1-3微升引物20.2-0.5微升10XBuffer 0.5微升巢CH10.2-0.5微升dNTP0.2-0.8微升巢CH20.2-0.5微升Taq酶 0.1-0.3微升巢CH30.2-0.5微升Mg+ 1-5微升巢CH40.2-0.5微升上述反应的反应条件1X95℃3-6分钟28-40X95℃20-30秒45-70℃ 2-4分钟72-76℃ 1-3分钟 1X72℃10分钟1X4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全长ＦＲＯ↓［２］基因的克隆和构建，其克隆的步骤为：（１）拟南芥植株中ＲＮＡ的提取；（２）通过该ＲＮＡ的反转录ｃＤＮＡ的合成；（３）对合成的ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增；（４）全长ＦＲＯ↓［２］－ＰＣＲ扩增基因的分离和纯化；（５）全长ＦＲＯ↓［２］－ＰＣＲ扩增基因的克隆；（６）全长ＦＲＯ↓［２］－ＰＣＲ扩增基因转化大肠杆菌；（７）全长ＦＲＯ↓［２］基因克隆的筛选；（８）全长ＦＲＯ２克隆基因的酶切鉴定；（９）全长ＦＲＯ↓［２］基因序列的确认；其构建的步骤为：（１）带特异性粘性末端的全长ＦＲＯ↓［２］基因的大量富积；（２）带有特异性粘性末端的质粒ｐＣＢ３０２－３的大量富积；（３）ＦＲＯ↓［２］／ｐＣＢ３０２－３质粒的构建；其特征在于：在对合成的ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增步骤时，根据拟南芥的抗缺铁基因的基因序列以及ＰＲＩＭＥＲ３软件设计引物，该引物包括全长的基因两端带有酶切位点的两个引物以及根据基因内部保守序列设计的两对巢式引物，共三对引物；这三对引物建立如下ＰＣＲ反应：Ｈ↓［２］Ｏ２５微升引物１０．２－０．５微升ｃＤＮＡ１－３微升引物２０．２－０．５微升１０ＸＢｕｆｆｅｒ０．５微升巢ＣＨ１０．２－０．５微升ｄＮＴＰ０．２－０．８微升巢ＣＨ２０．２－０．５微升Ｔａｑ酶０．１－０．３微升巢ＣＨ３０．２－０．５微升Ｍｇ↑［＋］１－５微升巢ＣＨ４０．２－０．５微升上述反应的反应条件：１Ｘ９５℃３－６分钟２８－４０Ｘ９５℃２０－３０秒４５－７０℃２－４分钟７２－７６℃１－３分钟１Ｘ７２℃１０分钟１Ｘ４℃∞。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨静慧，向成斌，刘艳军，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：12[]