全长FRO**基因的克隆和构建制造技术

本发明专利技术属于植物基因工程领域的一种全长ＦＲＯ↓［２］基因的克隆和构建。主要特征是在对合成的ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增步骤时，根据拟南芥的抗缺铁基因的基因序列以及ＰＲＩＭＥＲ３软件设计引物，该引物包括全长的基因两端带有酶切位点的两个引物以及根据基因内部保守序列设计的两对巢式引物并建立ＰＣＲ反应。本发明专利技术提出了高质量的总ＲＮＡ的提取方法和高质量的ｃＤＮＡ的合成以及两轮多重巢式ＰＣＲ技术和ＰＣＲ反应条件的优化技术，实现在国内首次高效、方便、快速地克隆和构建限速酶基因Ｆｅ↑［３＋］－螯合物还原酶基因－ＦＲＯ↓［２］基因，并将影响植株铁素吸收和代谢的全长ＦＲＯ↓［２］导入苹果并建立了苹果的高效农杆菌介导的转化体系。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
所属领域本专利技术属于农业生物
或植物基因工程领域，尤其是一种全长FRO2基因的克隆和构建。
技术介绍
果树具有多年生、童期长、自交不亲和、杂合程度高、多无性繁殖等特点，使采用基因转移技术获得转基因植物新品种逐渐成为果树育种的重要手段。最早是1988年以核桃体系为外植体，通过农杆菌介导，获得了转基因植株。而后又在许多果树上进行了研究，如在核桃上又相继导入了ICP基因和CHS基因，猕猴桃上已转入水稻的homebox基因，Sagi等在香蕉中转入控制开花的基因，Gervera等在柑橘中转入了耐盐基因HAL2，并已得到再生植株，Bell等在梨中转入了rolC基因。1996年Eide等人从拟南芥中克隆到第一个高等植物的Fe2+转移蛋白基因-IRT1(Iron Regulated Transporter)。IRT1在酵母中的表达能使因缺乏铁吸收能力的酵母双突变体fet3fed4的受缺铁限制的生长恢复。但至今还未见到有人将此基因导入高等植物植株的报道。双子叶植物吸收研究的另一重大进展是1999年，Robinson等人首次从拟南芥中分离到了Fe3+-螯合物还原酶的基因-FRO2(Ferric-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种全长ＦＲＯ↓［２］基因的克隆和构建，其克隆的步骤为：（１）拟南芥植株中ＲＮＡ的提取；（２）通过该ＲＮＡ的反转录ｃＤＮＡ的合成；（３）对合成的ｃＤＮＡ的ＰＣＲ扩增；（４）全长ＦＲＯ↓［２］－ＰＣＲ扩增基因的分离和纯化；（５）全长ＦＲＯ↓［２］－ＰＣＲ扩增基因的克隆；（６）全长ＦＲＯ↓［２］－ＰＣＲ扩增基因转化大肠杆菌；（７）全长ＦＲＯ↓［２］基因克隆的筛选；（８）全长ＦＲＯ２克隆基因的酶切鉴定；（９）全长ＦＲＯ↓［２］基因序列的确认；其构建的步骤为：（１）带特异性粘性末端的全长ＦＲＯ↓［２］基因的大量富积；（２）带有特异性粘性末端的质粒ｐＣＢ３０２－３的大量富积；（３）ＦＲＯ↓［２］／ｐＣＢ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨静慧，向成斌，刘艳军，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：12[]