对虾白斑和桃拉综合症病毒的二温式多重PCR检测方法技术

本发明专利技术提供一种对虾白斑综合症病毒（Ｗｈｉｔｅ　　ｓｐｏｔ　　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　　ｖｉｒｕｓ，ＷＳＳＶ）和桃拉综合症病毒（ｔａｕｒａ　　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　　ｖｉｒｕｓ，ＴＳＶ）的二温式多重ＰＣＲ快速检测方法。该检测技术首先根据白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因保守序列设计两对特异引物，建立一种二温式多重ＰＣＲ技术用于对虾病毒的同时复合检测的方法。该二温式多重ＰＣＲ技术操作简便，特异性好，灵敏度高，既能缩短病原检测时间，又能节约检测费用，可用于对虾白斑综合症和桃拉综合症的同时早期检测，及各养殖时期虾体的健康状况调查研究，对控制对虾疾病的流行有着重要的意义，同时对于对虾的其它病原鉴别诊断有一定的参考价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水生动物病害的检测技术，主要是针对对虾白斑综合症病毒(White spotsyndrome virus，WSSV)和桃拉综合症病毒(taura syndrome virus，TSV)的同时检测。
技术介绍
白斑综合症病毒是对虾白斑综合症的病原，以病死虾体外壳内侧呈现白色斑点而得名，中国在1992年首先在台湾发现对虾白斑综合症，此病在沿海地区迅速曼延，成为中国对虾养殖的最主要威胁。马来西亚、印度尼西亚、泰国、日本、菲律宾、韩国及美国部分地区也相继发现白斑综合症病毒病害。该病毒分子量较大、结构特异，是已知动物病毒中最大的病毒，属于双链DNA病毒，完整的病毒形态呈现线团状，无包涵体，有囊膜，一末端有尾状结构。其宿主范围较广，除了感染对虾外，还可感染蟹类和一些桡足类生物等，危害较为严重。桃拉综合症病毒是对虾桃拉病的病原，也是主要危害南美白对虾的一种严重传染性病毒病。桃拉综合症病毒除了主要感染南美白对虾之外，还可危害红额角对虾和斑节对虾等对虾品种，1999年，桃拉综合症在我国台湾流行，接着该病进入我国大陆，2001年在我国东南沿海较多的养虾地区暴发。2002，2003年该病的危害进一步加剧，并向内地扩散。桃拉综合症病毒，属于单链RNA病毒，呈现二十面体结构，直径大约30nm，无包含体，无囊膜，被桃拉综合症病毒感染过的南美白对虾将导致60-90％的死亡率，而幸存下来的对虾将会作为桃拉综合症病毒的隐形感染者继续传播，从而导致更大的损失。白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒不仅能单独感染对虾，而且二者往往能引起对虾的复合感染，更加大了对虾病害防治的难度。目前，对于对虾病毒病尚无有效的治疗方法，病害防治的重点在于早期检测，提前预防，以减少因病害相互感染暴发带来的严重损失。对对虾疾病的检测主要有传统的组织病理学方法、血清免疫学方法以及现代分子生物学方法，其中分子生物学方法中聚合酶链反应(PCR)检测技术的应用较为广泛，二温式PCR和多重PCR均是PCR的一种特殊形式，它们用于对虾病害病原的检测国内已有报道，比如庞耀珊等将二温式PCR用于白斑综合症病毒的检测，夏春等将多重PCR应用于对虾皮下和造血器官坏死杆状病毒的检测，本项专利技术即二温式多重PCR集中了二温式PCR和多重PCR的优势，能够同时有效地快速检测对虾白斑综合症和桃拉综合症两种病毒，使得检测更加快速简便，省时省力，这在对虾病原的检测中尚无报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是集中二温式PCR和多重PCR的优势，分别利用白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因保守序列设计两对引物，建立并优化二温式多重PCR反应体系和反应程序，能够同时检测对虾白斑综合症和桃拉综合症两种病毒，简便了试验操作程序，加快了诊断速度，又节约了试验费用，从而对疾病早发现、早处理、尽可能减少因病害暴发带来的经济损失有着重要的意义。利用该PCR能特异扩增出白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因片段，而对其它一些对虾病原呈现阴性，且该PCR最低能检测到白斑综合症病毒核酸模板10pg，桃拉综合症病毒核酸模板100pg，结果表明，该PCR具有较高的特异性和敏感性，既节省了时间，又节约了试验费用，可用于白斑综合症病毒病和桃拉综合症病毒病的同时早期诊断及各养殖时期虾体的健康状况调查研究，对控制对虾疾病的大规模流行有着重要的意义，同时对于对虾的其它病原鉴别诊断有一定的参考价值。为实现上述目的采取的技术方案。根据已报道的白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因组序列，分别找出它们的保守区域，设计两对特异引物，用于白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的基因片段扩增。利用简便、有效的核酸提取法从患病对虾组织中提取基因组总DNA，利用TRIzol试剂盒从患病对虾组织中提取RNA，并利用RT-PCR反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。设计该二温式多重PCR的反应体系和扩增程序，将核酸进行扩增，利用凝胶电泳分析扩增结果及特异性，同时利用十倍递近稀释法检测该二温式多重PCR的敏感度。技术方案的中心内容1.根据已报道的白斑综合症病毒基因组序列(VanHulten，m.c.，Witteveldt，J.，Peters，S.，kloosterboer，N.，Tarchini，R.，Fiers，M.，Sandbrink，H.，Lankhorst，R.K.，Vlak，J.M.，2001b.The white spot syndrome virus DNA genome sequence.Virology 286，7-22.)和桃拉综合症病毒基因组序列(Mari，J.，Poulos，B.T.，Lightner，D.V.，Bonami，J.R.，2002.ShrimpTaura syndrome virusgenomic characterization and similarity with members of the genus Cricketparalysis-like viruses.J.Gen.Virol.83，915-926)分别设计针对白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的特异引物F1、R1，F2、R2。2.白斑综合症病毒DNA提取；3.桃拉综合症病毒RNA提取及cDNA的合成；4.二温式多重PCR的扩增；5.琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果；6.二温式多重PCR特异性及敏感性检测。本专利技术与现有技术相比所具有的优点和积极效果与白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的常规PCR检测技术相比，该二温式多重PCR打破常规的三温循环和病原单个检测，能在一个体系中同时检测到白斑综合症病毒和桃拉综合症两种病毒，既能缩短检测时间，提高工作效率，又能节约试验费用，实验证明具有较高的特异性和敏感度，可用于白斑综合症病毒病和桃拉综合症病毒病的早期诊断及各养殖时期虾体的健康状况检测，防止病毒的暴发流行，并对于对虾的其它病原鉴别诊断有一定的参考价值。具体实施例方式本专利技术的实施例1.设计分别针对白斑综合症病毒(WSSV)和桃拉综合症病毒(TSV)的两对特异引物F1、R1，F2、R2。用于扩增白斑综合症病毒特异基因片段大小为451bp，其中上游引物F1为5’GCCCTGGAGAACACGTCC 3’，下游引物R1为5’TGGCGAACGGTGCAAGAGCC3’；用于扩增桃拉综合症病毒特异基因片段大小为231bp，其中上游引物F2为5’AAGTAGACAGCCGCGCTT 3’，下游引物R2为5’TCAATGAGAGCTTGGTCC3’；2.白斑综合症病毒DNA提取取病虾的部分肝胰腺、胃、肠、肌肉，用剪刀剪碎，混匀后取约100mg样品。将样品置于液氮中研磨，加入1.3ml裂解液(成分包括Tris、EDTA、SDS)、7.5ul蛋白酶K，转移到5ml的离心管中，放于65℃水浴中消化3h，冷却后离心去除沉淀，加700ul苯酚，12000r/min离心5分钟，三次，去除蛋白，收集上清于另一离心管中，加600ul酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，12000r/min离心5分钟，取上清，再加500ul氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000r/min离心5分钟，收集上清加100ul 10mol/l醋酸铵及1ml乙醇，于4℃放置30分钟沉淀DNA，用70％乙醇洗涤2次，5000r/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
对虾白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的二温式多重ＰＣＲ快速检测的方法，其特征是包含下列工作内容：（１）分别设计针对白斑综合症病毒和桃拉综合症病毒的两对特异引物Ｆ１、Ｒ１，Ｆ２、Ｒ２；（２）白斑综合症病毒ＤＮＡ提取；（３ ）桃拉综合症病毒ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成；（４）二温式多重ＰＣＲ的建立；（５）琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果；（６）二温式多重ＰＣＲ特异性及敏感性检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴刘记，吴信忠，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]