本发明专利技术利用对虾白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）基因表达技术，获得一种对虾白斑杆状病毒ＷＳＶ２３７基因编码的蛋白起名ＶＰ２９２。本发明专利技术还涉及ＶＰ２９２的生产方法，ＶＰ２９２多核苷酸和多肽的应用以及与ＶＰ２９２多肽特异性结合的抗体。对该基因及其表达产物的抑制可能是防治对虾白斑病的有效途径之一，有望运用于对虾白斑病的防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因生物工程
具体地说，本专利技术涉及对虾白斑综合征病毒 VP292的核苷酸序列，还涉及由该核苷酸序列编码的一种多肽。本专利技术还涉及这些多核苷酸 和多肽的应用，以及所述多核苷酸和多肽的生产方法。
技术介绍
对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾 的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋 生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，因此 它不仅严重危害对虾养殖，还对海洋生态造成了影响。WSSV是双链DNA病毒，基因组全长 305Kb，是迄今为止发现的最大的动物病毒(J Virol. 2001,75 :11811_11820)。基因组序列 遗传及形态学特征都表明WSSV是一种新病毒，它不属于目前已知的任一种病毒家族，因此 国际病毒分类委员会将WSSV归属为新的Whispovirus属，Nimaviridae种(www. ncbi. nlm. nih. gov/ICTVdb/Ictv/index. htm)。由于这是一个全新的病毒，而且WSSV基因组较大，所 以绝大多数WSSV病毒结构蛋白与其他病毒没有同源性，因此这些蛋白的功能无法通过与 其他病毒蛋白的同源性分析进行预测，因而使WSSV功能研究具有极大的难度。已有20余 个基因初步确证其功能，尚有许多基因的功能未知。目前还难以对WSSV进行预防和控制， 一方面由于WSSV能在自然环境中存活长时间，更重要的是人们对此病毒分子水平的了解 还很少。已有研究表明，虽然对虾等无脊椎动物没有类似于脊椎动物的适应性免疫系 统，但最新的研究发现，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。Witteveldt， J等人首先用PET28原核表达载体表达VP28蛋白用于制备亚单位疫苗，试验结果效果 很好(Witteveldt, J. , Cifuentes, C. C. , Vlak, J. M. , van Huhen, M. C. ff. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oralvaccination.J Virol. 2004. 78(4) =2057-2061) 0贾启军(贾启军，孟小林，徐进平等.对虾白斑综合症病 毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用.2006，21 (6) 585-588)等人用WSSV囊 膜蛋白VP19免疫螯虾，证实了 VP19也可以作为亚单位疫苗应用于预防WSSV。鉴于VP28和 VP19都对白斑综合症病毒有很好的防治效果，有些研究人员着手研究是否其他的一些结构 蛋白也可以对白斑综合症病毒产生免疫的效果。而结果也证实了当初的设想，已经证实的 如VP37，VP187都可以有效地抑制白斑综合症病毒的感染(Qing-hui Liu, Xiu-LiZhang, Cui-Yan Ma, Yan Liang, Jie Huang. VP37 of white spot syndrome virus interactwith shrimp cells.Letters in Applied Microbiology. 2009. 4844~50 ；Deng-Feng Li, Ming-Chang Zhang, Hai-Jie Yang, Yan—Bing Zhu, Xun Xu, 3 -integrin mediatesffSSV infection. Virology. 2007368 :122_132)。由于WSSV具有广泛的宿主范围，在甲壳纲和昆虫纲动物中均有其敏感的宿主，以 虾、蟹等十足目类为多。目前，普遍认为WSSV存在水平传播(经口感染或浸泡感染)及垂直传播两种传播途径，可独立在动物中流行，因此难于在短期内彻底消除。而WSSV为暴发性 传染病，该病感染率和死亡率都极高，所以研究针对WSSV的全新预防用的安全有效疫苗， 实数当务之急。基因工程疫苗技术是一项新兴的具有应用前景的生物技术，对WSSV囊膜蛋 白的表征为发展免疫途径预防WSSV感染提供技术方法。
技术实现思路
本专利技术中的编码VP292序列是如此获得的。以纯化的WSSV基因组DNA作为模板。 根据WSV237序列设计合成SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4的序列作为引物，经PCR扩增获得 了 WSV237的部分序列SED ID No. 1的序列。然后通过重组表达WSV237基因，纯化WSV237 基因的表达产物，动物活体实验分析其在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用。在本专利技术被公 布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的VP292序列。本专利技术的目的是提供一种新的WSSV多肽，它包括具有SEQ ID No. 2氨基酸序列 的多肽，或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳，该多肽是具有SEQID No. 1序列的多肽。 此蛋白被命名为VP292。本专利技术的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的VP292的方法。本专利技术还提供了 VP292的应用，即蛋白疫苗，其含有VP292编码序列，以及药学上 可接受的载体。更明确的，本专利技术的这种疫苗含有SEQ ID No. 2中所述的氨基酸序列或其 衍生序列。此外，本专利技术的核酸序列可以被用来制造核酸疫苗，对甲壳动物进行接种，以抗 WSSV感染。载体疫苗包括活的减毒细菌或病毒疫苗，以及药学上可接受的载体。在本专利技术的一个具体实施方案中，本专利技术中分离的多核苷酸全长为876个核苷 酸，其详细序列见SEQ ID No. 1，其中开放阅读框位于1-876位核苷酸。另一方面，本专利技术还包括对VP292DNA或是其片段编码的多肽能特异性相互作用 的多克隆抗体、单克隆抗体及其它能抑制VP292基因产物或片段。本专利技术的技术方案如下1. WSSV-VP292 基因的制备(1)采用酚-氯仿法提取DNA。取400 ill纯化的病毒液，加入DNA抽提缓冲液 5. 3u 1,0. 5mol/L 的 EDTA (pH8. 0) 106. 7 u 1，胰 RNA 酶 6. 5ul 禾口 10% SDS 28 u 1，37°C 下温 育lh。加入蛋白酶1((201^/1111)4111，501孵育3-411。用酚氯仿异戊醇(25 24 1) 和氯仿各抽提1次，乙醇沉淀，收集DNA，用TE缓冲液稀释DNA至100 u g/ml，用于PCR反应 的模板。(2)PCR扩增VP292基因以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP292。PCR反应条 件为20ii 1 反应体系中含双蒸水 14ii L，2. 5ii L 10x PCR buffer, 0. 5 u L25mmol/L MgCl2, luL dNTPs，上、下游引物各 0. 5iiL，0. 5iiL Taq DNA 聚合酶(5U/L)，0. 5 y L 模板。PCR 反 应条件94°C 10min，94°C 30s,51. 0°C 30s，72°C lmin(8 个循环)，94°C 30s, 56. 2 °C 30s, 72 °C lmin(30个循环)，72°C lOmin。取2 yl P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码ＶＰ２９２活性多肽的核苷酸序列一部分，或者所述核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１中１－８７６位的核苷酸序列有至少７０％的相似性，或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１中１－８７６位的核苷酸序列杂交。
【技术特征摘要】
一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码VP292活性多肽的核苷酸序列一部分，或者所述核苷酸序列与SEQ ID NO.1中1 876位的核苷酸序列有至少70％的相似性，或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID NO.1中1 876位的核苷酸序列杂交。2.如权力要求1中所述的DNA序列，其特征在于，所述的序列编码一条多肽，该多肽具 有SEQ ID N0.2所示的序列。如权力要求1中所述的DNA序列，其特征在于，该序列具有 SEQ ID NO. 1中从核苷酸1-876位的核苷酸序列。3.一种分离的VP292多肽，其特征在于，它包括，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列 的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。4.如权力要求3所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQID NO. 2序列的多肽。5.一种产生具有VP292活性多肽的方法，其特征在于，该方法包括1...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆慧，黄捷，陈文博，梁艳，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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