本发明专利技术公开了一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白ＶＰ３７的重组酵母菌的制备方法，是利用酵母表面展示载体ｐＹＤ１，与对虾白斑综合征病毒蛋白ＶＰ３７基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌ＥＢＹ１００，得到表面展示ＶＰ３７的重组酵母菌。其特征在于含有对虾白斑综合征病毒蛋白ＶＰ３７基因的重组酵母菌ＥＢＹ１００，所述的重组酵母菌表面有ＶＰ３７。本发明专利技术的另一个目的是提供表面展示对虾白斑综合征病毒ＶＰ３７重组酵母活疫苗在甲壳类动物养殖中的应用。所制备的重组酵母菌可以作为口服疫苗免疫对虾，用来保护对虾免受对虾白斑综合征病毒的侵染。本发明专利技术的基因工程活疫苗的优点在于，所用酿酒酵母菌安全，培养方法简单易行，便于大规模生产。相对于其它疫苗，展示的ＶＰ３７蛋白易被免疫系统识别，展示的ＶＰ３７蛋白稳定性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基因工程技术，具体地说，本专利技术涉及对虾白斑综合征病毒结 构蛋白VP37酵母表面展示方法，本专利技术还涉及展示的对虾白斑综合征病毒VP37的生产 方法与应用。
技术介绍
对虾白斑杆装病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾 的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海 洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范 围，给水产养殖业造成严重的经济损失。因此针对对虾白斑综合征病毒的药物开发受到 广泛关注。对虾为无脊椎动物，不具备特异性免疫系统，但近年的研究表明，对虾存在类 免疫(quasi-immune)应答机制，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。 目前有关对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导产生高效免疫应答能力的 囊膜蛋白进行免疫接种方式来展开。已研发的包括以WSSV结构蛋白为抗原的蛋白类 疫苗(Witteveldt J, Cifuentes C C， Vlak J M, et al.Protection of Penaeusmonodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination.Journal of Virology，2004, 2057—2061.禾口 Vaseeharan B, Anand T P, Murugan Τ, et al.Shrimp vaccination trials with the VP292protein of white spotsyndrome virus.Letters in Applied Microbiology, 2006, 137—142.禾口 Jha R K, Xu Z R, Shen J, Bai S J，et al.Theefficacy of recombinant vaccines against white spot syndrome virus in Procambaras clarkii.Immunology Letters，2006, 105 68-76 等)、 核 酸类疫苗(Rout N，Kumar S，Jaganmohan S，et al.DNA vaccines encoding viralenvelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp.Vaccine, 2007, 25: 2778-2786.禾口 Rajeshkumar S，Venkatesan C, Sarathi Μ.Oral delivery of DNA vaccine encoding VP37against white spotsyndrome virus in crayfish by attenuated Salmonella typhimurium.Fish&Shellfish Immunology，2009，26(3) 429-437 等)。然而，为了增强 免疫效果的持续性并更有效地诱导对虾的细胞免疫应答，对虾用活疫苗的研究和开发受 到重视。以往研制人体和动物用活疫苗的方法主要是将病原体置于各种条件下培养，通 过诱导其发生基因突变而确立弱毒株的。采用这种方法研制活疫苗不仅需要很长时间， 而且存在很大的盲目性。而且长期以来，由于担心用于制备减毒活疫苗的病原菌在水体 中扩散和毒力回复的危险，各国均不允许使用减毒的活疫苗。现在，应用基因操作技术 可以将病原体上有免疫保护性的抗原基因克隆到非致病微生物载体上，从而使这种既能 表达目的抗原又没有致病性的微生物充当活疫苗的角色，又称为活载体疫苗。其中以酒 精酵母为载体，将目的蛋白表达在酵母菌体的细胞表面作为抗原递呈的口服活疫苗，在 小鼠和人体中的研究已有成功的报道。通过表面展示技术将对虾白斑综合征病毒VP37蛋白展示在酵母细胞表面，使多肽抗原更容易被免疫系统识别，同时酵母细胞表面成分可以起到免疫佐剂的作用。而且 酒精酵母菌为食品级微生物，具备安全、容易培养的优点，可以很容易地过渡到廉价的 口服疫苗，通过简单而又安全的方式接种。另外酒精酵母菌特有的遗传体系使之具有同 时表达几种不同蛋白抗原且以不同形式表达的能力，从而可以制备多价联合疫苗。酒精 酵母根据交配型的差异分为MATa和ΜΑΤ α两种单倍体，其细胞表面分别表达α或&凝 集素。它们是酵母细胞壁上的两种甘露糖蛋白，可介导细胞间的粘附使细胞融合。目的 蛋白可分别与α或a凝集素融合，展示于酵母细胞表面。美国Iiwitrogen公司用于酒精 酵母表面展示的质粒载体pYDl可以使得外源蛋白与a凝集素C端融合表达在酵母细胞的 表面，并在目的蛋白的N端和C端分别设计了 Xpress，V5和6His等抗原表位，可以使 用相应的抗体通过免疫荧光染色法很方便地险测重组蛋白的表达。基于酵母细胞表面展 示技术的基因工程活载体疫苗，在对虾类疫苗的研究中至今未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种以酿酒酵母为载体的对虾白斑综合征病毒VP37的展示 方法，展示的对虾白斑综合征病毒VP37的重组酵母菌的生产方法，所制备的重组酵母菌 作为活疫苗有WSSV感染抑制作用，可以免疫对虾，用来保护对虾免受对虾白斑综合征 病毒的侵染。本专利技术的基因工程活疫苗的优点在于，所用酿酒酵母菌安全，培养方法简单易 行，经济价廉，便于大规模生产，可用于对虾白斑综合征病毒口服疫苗。相对于其它疫 苗，展示的VP37蛋白易被免疫系统识别，展示的VP37蛋白稳定性好。本专利技术的另一个目的是提供表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母活疫苗 在甲壳类养殖中的应用。本专利技术涉及编码VP37序列片段扩增的引物序列37-s GAAGAATTCATGGCGGTAAACTTGGAT37-a TCCCTCGAGTGTCCAACAATTTAAAA本专利技术所采用的技术方案是一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白VP37的重组酵母菌的制备方法，是利用 酵母表面展示载体pYDl，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因重组，构建融合表达的 重组质粒，并转化酿酒酵母菌EBY100，得到表面展示VP37的重组酵母菌。其特征在于 含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面 有 VP37。1.WSSV-VP37 基因的制备(I)WSSV病毒基因组的制备将提纯的病毒置于0.2mg/ml蛋白酶K和 月桂酰肌氨酸钠中，在65°C中静置2h。用氯仿和苯酚抽提后将得到的产物溶于50μ1 TE。-20°C保存，作为PCR扩增模板。(2斤€尺扩增￥ 37基因以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP37，凝胶电泳检测扩增PCR产物大小，回收PCR产物。PCR反应条件94°C变性5min， 94°C 40s, 56°C 40s, 72°C 40s, 35 个循环，72°C延伸 5min。取 2 μ IPCR 产物作 1 %琼脂 糖凝胶电泳。2.重组体的构建(1)表达载体的构建用EcoRI和XhoI对VP37基因片段和质粒pYDl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表面展示对虾白斑综合征病毒ＶＰ３７重组酵母及其制备方法，是利用酵母表面展示载体，与对虾白斑综合征病毒蛋白ＶＰ３７基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌得到表面展示ＶＰ３７的重组酵母菌。
【技术特征摘要】
1.一种表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母及其制备方法，是利用酵母表面 展示载体，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转 化酿酒酵母菌得到表面展示VP37的重组酵母菌。2.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母及其制备方法， 其特征在于，所述的重组酵母为含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因的重组酵母菌 EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP37。3.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母菌活疫苗在养殖 甲壳动物免疫中的应用。4.如权利要求2所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组体的制备方法，其特 征在于，构建所述的对虾白斑综合征病毒VP37表达载体时，先用EcoRI和XhoI两种限 制性内切酶将PCR扩增的VP37产物与pYDl空载体分别双酶切，然后将双酶切的产物连 接并转化入感受态大肠杆菌TOPIO，PCR筛选插入VP28基因的阳性克隆，测序验证正确 的阳性克隆即为重组表达体(pYDl-VP37)。5.如权利要求4所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组体，其特征在于， 它包括编码VP37的核...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆慧，黄捷，李新新，张秀丽，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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