本发明专利技术涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法，特别是枯草芽孢杆菌芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒Ｖｐ２８蛋白的重组芽孢。该方法利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与对虾白斑综合征病毒表面抗原蛋白基因重组，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白的重组芽孢。
【技术实现步骤摘要】
-本专利技术涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法，特别是枯草芽孢杆菌 芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒Vp28蛋白的重组芽孢。
技术介绍
对虫下白斑综合征是由白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,简称为 WSSV)引发的一种综合性病症，给对虫下养殖造成巨大的经济损失，对虾白斑综 合征病毒疫苗是控制病毒感染最为有效的措施。斑节对虾口服接种在大肠杆菌中 表达的重组WSSV囊膜蛋白rVp28，保护率达77% (Witteveldt J, et al. 2004. J! Wro/. 78(4):2057-61)。但重组的Vp28或Vpl9蛋白疫苗在水体环境中稳定性差、利用率 低；口服可溶性抗原(或重组抗原)疫苗易被消化道内的蛋白酶所降解、耐受性 差、储存时间短，因此难以大规模应用于对虾白斑综合征病毒感染的控制。利用 枯草芽孢杆菌(fecW"ss"6"h's)营养细胞分泌性表达Vp28，并通过对虾口 服该重组枯草芽孢杆菌芽孢后在消化道中萌发成营养细胞分泌性表达Vp28，可 使对虫下获得抗病毒感染能力(Hu LL， et al. 2008. Z饥M'croWo/, 46 (2008) :581-586)，但免疫能力依赖于芽孢在消化道中的停留时间和分泌性表达的 Vp28的降解程度，因难以完全有效的通过对虾消化道屏障的而限制其免疫效果。 对虾口服重组可溶性Vp28抗原产生的抗WSSV感染的免疫学机制目前还不清 楚。5aw'L "s ^/A"h's为环境友好菌，其芽孢具有独特的抗逆性、容易培养、 芽孢比重大易分离、不需要复杂的分离纯化操作；芽孢具有独特的抗逆特性，能 在极端环境(如高温、干燥、化学药物)中长期存活，可顺利通过动物消化道屏 障，可作为极端环境(如胃肠道)下异源蛋白或生物活性分子的载体(OggioniMR， et al. 2003. r固'"e. 21: 96-101)。本专利技术的目的在于将Vp28蛋白展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建表面展 示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢，使Vp28蛋白获得 良好抗逆性，适用于对虾口服接种，但迄今尚未见类似的报道或专利技术专利。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的重组芽孢的制备方法。该方法以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，通 过芽孢表面展示技术将对虾白斑综合征病毒保护性抗原蛋白Vp28展示于枯草芽 孢杆菌芽孢表面，制备枯草芽孢杆菌重组芽孢。 本专利技术所釆用的技术方案是一种，是利 用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与对虾白斑综合征病毒表面抗原 蛋白基因重组，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草 芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示对虫下白斑综合征病毒蛋白 的重组芽孢。本专利技术选择具有转化能力且可产芽孢的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的 转化菌株，如&c/77"s w6h7ys 168及其系列衍生菌株(Bacillus Genetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210， USA);选择芽孢衣壳蛋白基因cot(f (GeneBanK序列号NP—389653)和c^"Gene BanK序列号NP—391488)作 为表面展示蛋白的分子载体，选择对虾白斑综合征病毒衣壳抗原蛋白基因^i"《 为被重组基因。本专利技术涉及本专利技术所选择的芽孢衣壳蛋白基因c"a卩c"6分别与r/^權因 编码序列重组后构建的重组质粒，在这些重组质粒中分别含有芽孢衣壳蛋白基因 的启动子、不含终止密码子的编码序列与^^堪因的编码序列重组后的基因，可 在枯草芽孢杆菌分化形成芽孢芽孢时分别融合表达CotC-Vp28、 CotG-VP28.本专利技术还涉及本专利技术构建的融合表达CotC-Vp28、 CotG-Vp28的重组质粒转 化枯草芽孢杆菌筛选所得到的重组菌株，这些重组菌株诱导形成的芽孢表面展示 Vp28，并可通过荧光免疫检测其芽孢表面展示重组蛋白VP28。 本专利技术涉及基因v/^S编码序列片断扩增的引物序列 vp28-1: GAGACGAGCTCTCGGTCGTGTCGGCCATCC vp28-2:GAGACGAATTCTTACTCGGTCTCAGTGCCAG 本专利技术涉及基因co/C启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物序列cotC-1: GACTGAGTCTAGATGTTCAAAATAAATGCATTCcotC匿2:GACTGAGGGTACCGTAGTGTTTTTTATGCTTTTT 本专利技术涉及基因"/G启动子及不含终止密码子的编码序列片段扩增的引物 序列cotG-l: GACAGGTCTAGACTCTGCCTTTGGAGACAGTGTCCC cotG-2: GAG AC AGGT ACCGTCGTCGC AGTGGTGGTGCG本专利技术涉及枯草芽孢杆菌淀粉酶基因"Wy-五片段扩增的引物序列呵E-1 :CATTGCTCGGGCTGTATGACTGG amyE-2: GATTGTGAATTGATCTCCATCC与本领域已知的方法相比，本专利技术方法将对虫下白斑综合征病毒Vp28展示于 枯草芽孢杆菌芽孢表面，利用芽孢所具有的独特抗逆性，使Vp28顺利通过对虾 消化道屏障。本专利技术构建的表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Vp28的枯草芽孢 杆菌重组芽孢，可用于对虾抗白斑综合征病毒的口服重组疫苗，相对于其他重组 Vp28抗原，具有更好稳定性。 附图说明图1专利技术人克隆的WSSV ^i^基因编码序列在Gene Bank中搜索比对结果 图2融合表达CotC-Vp28整合性重组质粒pJS253结构示意图。azy^f -ey^和湖7j^ ^ -朋y分别表示淀粉酶基因编码序列的5'端和3'端DNA片断，通 过双交换整合在fe"〃M sM"7" 168( f/p-)染色体的淀粉酶基因中；iS5/", ^/分别表示氯霉素抗性基因，红霉素抗性基因和青霉素抗性基因，用于在大肠 杆菌或5ac//7us su6G7is 168 ( f/p-)中的筛选；c^d/ i^为在"acj'"〃s w/b"7^168 (trp-)芽孢中融合表达CotC-Vp28重组蛋白的基因片段，该片段 含co《启动子序列、不含co《终止密码子的CotC编码序列，以及Vp28的全编 码序列。为大肠杆菌复制子片段图3菌株DRJS253表面展示Vp28的重组芽孢荧光免疫鉴定。A可见光下观 察菌株DRJS253重组芽孢(10X100油镜)；B紫外下光观察菌株DRJS253重组芽 孢。兔抗-Vp28多克隆抗体与重组賴^"^"^^f廣菌株DRJS253重组芽孢结合后， 与以FITC荧光素标记羊抗兔IgG抗体免疫反应，荧光显微镜(10X100油镜) 观察并拍照。图4融合表达CotG-Vp28整合性重组质粒pJS256结构示意图。a^^f -朋V 和湖yf <T -e/^分别表示淀粉酶基因编码序列的5，端和3，端DNA片断，通过双交换整合在5aw77w本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白Ｖｐ２８的重组芽孢的制备方法，其特征在于，利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与对虾白斑综合征病毒表面抗原蛋白基因重组，构建融合表达的整合性重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白的重组芽孢。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宁德刚，徐卫东，李倩，吴春笃，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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