本发明专利技术利用对虾白斑综合征病毒（ＷＳＳＶ）基因表达技术，获得一种对虾白斑杆状病毒ＷＳＶ２５４基因编码的片段起名ＶＰ３７ｐ。本发明专利技术还涉及ＶＰ３７ｐ的生产方法，ＶＰ３７ｐ多核苷酸和多肽的应用以及与ＶＰ３７ｐ多肽特异性结合的抗体。本发明专利技术首次通过生物学方法鉴定了ＶＰ３７ｐ的功能，ＶＰ３７ｐ是ＷＳＳＶ粘附蛋白片段之一，对该基因及其表达产物的抑制可能是防治对虾白斑病的有效途径之一，有望运用于对虾白斑病的防治。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种对虾白斑综合征病毒(wssv)基因的核苷酸序列。具体地说，本发 明涉及对虾白斑综合征病毒VP37的核苷酸序列片段(VP37p)，还涉及由该核苷酸部分序列 编码的一种具有粘附活性的多肽。本专利技术还涉及这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多 核苷酸和多肽的生产方法。
技术介绍
对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾 的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋 生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，因此 它不仅严重危害对虾养殖，还对海洋生态造成了影响。WSSV是双链DNA病毒，基因组全长 305Kb，是迄今为止发现的最大的动物病毒(J Virol 200175:11811-11820)。基因组序列 遗传及形态学特征都表明WSSV是一种新病毒，它不属于目前已知的任一种病毒家族，因此 国际病毒分类委员会将WSSV归属为新的Whispovirus属，Nimaviridae禾中(www. ncbi. nlm. nih. gov/ICTVdb/Ictv/index. htm)。由于这是一个全新的病毒，而且WSSV基因组较大，所 以绝大多数WSSV病毒结构蛋白与其他病毒没有同源性，因 此这些蛋白的功能无法通过与 其他病毒蛋白的同源性分析进行预测，因而使WSSV功能研究具有极大的难度。已有20余 个基因初步确证其功能，尚有许多基因的功能未知。目前还难以对WSSV进进预防和控制， 一方面由于WSSV能在自然环境中存活长时间，更重要的是人们对此病毒分子水平的了解 还很少。粘附是病毒粘附蛋白与细胞受体的结合过程，粘附启动病毒与宿主细胞的相互作 用，是建立感染、损伤细胞的必然途径。病毒入侵宿主细胞前的识别和粘附是引发感染的关 键步骤，病毒只有与细胞受体结合才能进入扩增循环。近期的研究结果表明，WSSV感染宿 主细胞的初期，必须具有完整囊膜结构，表明WSSV感染宿主细胞初期必须首先经过一个亲和吸附和相互作用的过程。阻断这一过程，将可能达到抑制wssv感染的目的。目前已有应用WSSV囊膜蛋白作为疫苗防止WSSV的专利，包括利用WSSV的VP28， VP26， VP24， VP19等。 WSV254编码的多肽片段活性分析表明VP37p不仅是WSSV的一种囊膜蛋白，而且为WSSV感 染虾体的粘附蛋白片段，更进一步指出是RGD位点在起作用。本专利技术的创新处在于，应用粘 附蛋白多肽片段从阻断WSSV与宿主相互作用控制WSSV的感染。
技术实现思路
本专利技术中的编码VP37p序列是如此获得的。以纯化的WSSV基因组DNA作为模板。 根据WSV254序列的一部分(133bp-299bp)设计合成SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4的序列 作为引物，经PCR扩增获得了 WSV254的部分序列SED ID No. 1的序列。然后通过重组表达 VP37p基因，纯化VP37p基因的表达产物，通过ELISA方法与荧光标记的方法，确定其与对虫下 细胞的结合活性，动物活体实验分析其在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用。在本专利技术被公 布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的VP37p序列。 本专利技术的目的是提供一种新的WSSV多肽，它包括具有SEQ ID No. 2氨基酸序列 的多肽，或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳，该多肽是具有SEQ ID No. l序列的多肽。 此蛋白被命名为VP37p。 本专利技术的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的VP37p的方法。 本专利技术还提供了 VP37p的应用，即蛋白疫苗，其含有VP37p编码序列，以及药学上 可接受的载体。更明确的，本专利技术的这种疫苗含有SEQ ID No. 2中所述的氨基酸序列或其 衍生序列。 此外，本专利技术的核酸序列可以被用来制造核酸疫苗，对甲壳动物进行接种，以抗 WSSV感染。载体疫苗包括活的减毒细菌或病毒疫苗，以及药学上可接受的载体。 在本专利技术的一个具体实施方案中，本专利技术中分离的多核苷酸全长为167个核苷 酸，其详细序列见SEQID No. l，其中开放阅读框位于1-167位核苷酸。 另一方面，本专利技术还包括对VP37p DNA或是其片段编码的多肽能特异性相互作用 的多克隆抗体、单克隆抗体及其它能抑制VP37p基因产物或片段。 本专利技术的技术方案如下 1. WSSV-VP37p基因的制备 (l)WSSV病毒基因组的制备将提纯的病毒置于O. 2mg/ml蛋白酶K和1%月桂酰 肌氨酸钠中，在65t:中静置2h。用氯仿和苯酚抽提后将得到的产物溶于50iU TE。 _20°C 保存，作为PCR扩增模板。 (2)PCR扩增VP37p基因以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP37p。 PCR反应 条件为50ii 1反应体系中含50ii L 10xPCR buffer, 4 iiL 25mmol/L MgC12， 1 ii L dNTPs， 上、下游引物各0. 5iiL，0. 5iiL Taq DNA聚合酶(5U/L) ，0. 5 y L模板。PCR反应条件 94°C 10min，94。C 30s，51.0。C 30s 72°C lmin(8个循环)，94°C 30s，56.2。C 30s，72。C lmin (30个循环)，72°C 10min。取2 yl PCR产物作1 %琼脂糖凝胶电泳，PCR产物应在约 170bp处有一条扩增带。 2.重组体的构建 (1)表达载体的构建用Xho I和Hind 11I对VP37p基因片段和质粒pBAD/glIIA 进行双酶切，酶切片段经过16t:连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提 取重组载体质粒，进行双酶切并对该重组载体质粒进行测序鉴定。 (2)目的产物VP37p的表达挑单菌落接种到含Amp的新鲜丰富LB液体培养基中， 37t:培养8 10h，之后按1%接种到新鲜的LB液体培养基中，37t:培养到OD值为0. 6时 加终浓度为0. 4mmol/L的阿拉伯糖诱导，离心收集菌体。将菌体裂解后分别收集上清和沉 淀，进行SDS-PAGE和Western-blot。 (3)纯化VP37p :将得到的裂解物沉淀收集，镍琼脂糖凝胶装柱，用缓冲液平衡2-5 个床体积，将收集的沉淀重悬(50mM PBS， pH7. 4， 0. 5M NaCl) 0. 45 y m滤膜过滤，上样流速 lml/min，选择在50mM的咪唑缓冲液的阶段选择洗脱，收集。 3.荧光显微镜观察VP37p与对虫下血细胞的作用 (1)荧光素标记纯化VP37p :荧光素FITC溶于DMSO中之后混合于lmg VP37p蛋 白。将混合物在室温下轻微振荡2h后，过G-50葡聚糖凝胶柱，使得没有标记的荧光素和与 VP37p蛋白结合的荧光素分离。用相同的方法标记BSA作为对照组。 (2)对虾血细胞原代培养将健康的克氏原螯虾用75%的乙醇拭擦，采用心脏取 血。离心分离后，取血细胞重悬于L-15培养基中。将细胞培养板密封后置于28t:直到有 70X-80X的单层贴壁细胞出现。将培养基和培养的血细胞分离之后，用PBS缓冲液洗涤细 胞。 (3)显微镜方法每个孔内加入100本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＷＳＳＶ粘附蛋白，其特征在于：表达蛋白具有与对虾细胞结合活性。
【技术特征摘要】
一种WSSV粘附蛋白，其特征在于表达蛋白具有与对虾细胞结合活性。2. —种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码VP37活性多肽的核苷酸序列一 部分，或者所述核苷酸序列与SEQ ID NO. 1中1-167位的核苷酸序列有至少70%的相似性， 或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ ID NO. 1中1-167位的核苷酸序列杂交。3. 如权利要求2中所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一条多肽，该多肽具 有SEQ ID NO. 2所示的序列。4. 如权利要求2中所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQID NO. 1中从核苷酸 1-167位的核苷酸序列。5. —种分离的VP37p多肽，其特征在于，它包括，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列 的多肽，或其活性片段，或其活性衍生物。6. 如权利要求5所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID N0.2序列的多肽。7. —种产生具有VP37p蛋白活性的多肽...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆慧，陈文博，黄捷，梁艳，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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