酸性神经磷脂酶（ＡＳＭ）活性的缺乏导致Ｎｉｅｍａｎｎ－Ｐｉｃｋ疾病。许多删除ＡＤＭ的Ｃ末端半胱氨酸氨基上的自由硫醇的活性的修饰导致该酶特异活性的显著增强。用于改变该残基活性的方法包括删除或改变该残基的定点突变，除去该残基的对该ＡＳＭ的酶降解，铜促进的ＡＳＭ的二聚化（通过末端半胱氨酸残基）和对该残基上的自由硫醇集团的化学修饰。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
酸性神经磷脂酶E.C.3.1.4.12，(ASM)是溶酶体中的磷酸二酯酶，其将在大脑、肝、肺、脾和淋巴结中发现的磷脂储存物质鞘磷脂水解为神经酰胺和胆碱磷酸。ASM活性的缺乏导致身体无法分解鞘磷脂，从而引起一种称为Niemann-Pick疾病的溶酶体贮积病。Niemann-Pick疾病是一种遗传性的常染色体隐性脂类存储障碍，其特征是在诸如巨噬细胞和神经细胞的溶酶体中过量累积鞘磷脂，这损害了细胞的正常功能。Niemann-Pick A型疾病是在婴儿中的一种快速进行性的神经变性疾病，并典型地导致在两、三岁时死亡。Niemann-Pick B型疾病导致肝和脾增大和呼吸困难，并且通常会在成年的早期死亡。这两种都与ASM缺乏有关的Niemann-Pick疾病在本文统称为Niemann-Pick疾病。其它类型的Niemann-Pick疾病，例如C型，不包括ASM基因的突变并且不直接归因于ASM的功能。酶替代疗法是一个众所周知的用于治疗溶酶体的存储疾病的方法。通过提供外源酶，酶替代疗法试图补充缺乏的酶活性。在使用酶替代疗法治疗Niemann-Pick疾病的情况中，目的是使得被治疗者能够加工处理鞘磷脂从而避免其在溶酶体中的累积。为了有效，该治疗的开始需要足够大量的代替酶以分解所累积的鞘磷脂，并且需要持续补给代替酶以避免随后进一步的鞘磷脂累积。ASM是具有六个由氨基酸顺序编码的潜能的N-糖基化位点的糖蛋白(Schuchman，E.H.et al，(1991)，J.Biol.Chem，Vol.266，8531-8539)。定点诱变研究显示六个位点中的至少使用五个位点(Ferlina，K.，EtAl.，(1997)，Eur.J.Biochem.Vol.243，511-517)。该研究还发现删除近N端的4个位点，不破坏溶酶体定位、加工处理或酶活性。然而，研究显示删除两个C端的N糖基化位点导致迅速切断原始翻译产物或者导致形成一个没有活性的ASM前体(Ferlina，K.，Et Al.，(1997)，Eur.J.Biochem.Vol.243，511-517)。通常接受在人体中，多种形式的ASM是有活性的观点，以及这些形式的特征在于具有不同的分子量和不同的糖基化模式。已描述了ASM循环发现的分泌型以及细胞内的溶酶体型都来自于相同的基因(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。在存在锌的情况下，从胎牛血清(Spence，M.W.，Et Al.(1989)J.Biol.Chem.Vol.264，5358-5363)或不同的培养细胞(Schissel，S.L.，Et Al.(1996)，J.Biol.Chem.Vol.271，18431-18436)获得的分泌型显示出增加的特异活性。Bartelsen Et Al.还发现由昆虫sf21细胞分泌的用于重组ASM的依赖于铜的活性(Bartelsen O.，Et Al.(1998)J.Biotechnol.Vol 63，29-40)。然而，溶酶体型的ASM不需要加入外源的锌以便激活，并且被称为“不依赖于阳离子”(Schissel，S.L.，Et Al.(1996)，J.Biol.Chem.Vol.271，18431-18436，Levade，T.，(1986)J.Clin.Chem.Clin.Biochem.Vol.24，205-220)。Schissel等报道溶酶体型和分泌型两种形式都可以被锌特异的螯合剂和1，10-邻二氮杂菲失活，并且因此得出两种形式分子的酶活性都需要锌的结论(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。这些显示锌已经紧密地与“不依赖于阳离子”的溶酶体型的分子结合，因而不需要外源的锌使其达到最大的活性。分泌型和溶酶体型的ASM之间的差别显示为它们不同的糖基化以及N端的不同(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。关于这两种形式的翻译后修饰，溶酶体型的ASM具有磷酸化和溶酶体定位所需的高的甘露糖型低聚糖，而分泌型的ASM含有复合型的N-连接的低聚糖。因为两种形式的ASM暴露于细胞的锌的不同以及因此对锌敏感性的不同的原因，而提出了两种形式的ASM的不同的转运途径(Schissel.，S.L.，Et Al.(1998)J.Biol.Chem.Vol.273，18250-18259)。由于溶酶体型ASM的蛋白水解过程，两种形式的ASM表现出不同的N端。两种形式的ASM的C端是否有不同还没有被测定出来，然而关于其它一些溶酶体酶的C端的加工过程已经报道，例如酸性α-葡萄糖苷酶(Wisseleaar.，H.A.，Et al，.(1993)J.Biol.Chem.Vol.268，16504-16511)和组织蛋白酶D(Yonezawa，S.，Et Al.，(1988)J.Biol.Chem.Vol.263，2223-2231；Lioyd，J.B.，Et Al.(1996)SubcellularBiochemistry(Harris，J.R.，Ed)Vol.27，Plenum Publishing Corp.，NewYork)。据提议，ASM中的组氨酸和谷氨酸残基可能参与了金属结合位点，对ASM的初始序列和已知锌金属蛋白的比较显示有7个潜在的锌结合位点(Ferlinz，K.，et al，.(1997)Eur.J.Biochem.Vol.243 511-517)。AMS中的锌的结合和与对应于金属离子协同作用的特异氨基酸的准确化学计量还需要进一步的测定。，就二硫键和游离半胱氨酸数目而言，ASM中的17个半胱氨酸残基的状态也仍然没有研究清楚。据显示，二硫苏糖醇(DTT)，而不是还原型的谷胱苷肽，能以浓度依赖的方式抑制ASM的酶活性(Lioyd，J.B.，Et Al.(1996)Subcellular Biochemistry(Harris，J.R.，Ed)Vol.27，Plenum Publishing Corp.，New York)。然而，这种失活的机理也仍然不清楚。因为已经报道DTT对蛋白活性的影响与二硫化物还原没有关系，所以这种失活可能不是简单的由于二硫化物还原(Lansmann，S.，et al.(2003)Eur.J.Biochem.Vol.270，1076-1088)。相对于ASM这种失活，溶酶体脂质和鞘脂类激活剂蛋白SAP-C显示可以激发ASM的活性(Liu，B.，Et Al.(1997)J.Biol.Chem.Vol.272，16281-16287)。如上文提及，已经证明酶替代疗法是治疗一些溶酶体贮积病的有效方法。关于ASM，在CHO细胞中表达的一种重组形式的此酶显示在包括酸性最适PH值、对巯基还原剂敏感性和被锌特异螯合剂抑制等方面和非重组形式的该酶一致的特性(Schuchman，E.H.，ET AL.(1992)Genomics Vol 12，197-205)。在纯化的重组人ASM(rhASM)蛋白的生化特性中，本研究专利技术者本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种增强人酸性神经磷脂酶（ＡＳＭ）活性的方法，其包括修饰人ＡＳＭ的Ｃ末端半胱氨酸残基。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：SM文帕腾，KP卡列耶，H邱，
申请(专利权)人：建新公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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