一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶技术领域。本发明专利技术的ALDH2基因高效表达组件Trp1L‑URA3‑TPIp‑ALDH2‑TPIt‑Trp1R是整合到了酿酒酵母W303‑1A的基因组上，与游离质粒表达相比，提高了基因表达的稳定性，并且采用的组成型启动子，在发酵过程中没有诱导剂的加入，产物相对来说比较安全。在发酵96h时，产乙醛脱氢酶的比活达到0.97U/mg。在250mg/100mL浓度的乙醇中，产乙醛脱氢酶的比酶活达到6.256U/mg，在pH 3缓冲液中，产乙醛脱氢酶的比活达到0.301U/mg。本发明专利技术选用酿酒酵母作为宿主菌，一方面保持了酶的活性，另一方面提高了产品的安全性，为解酒药的研发提供了一条新的途径和理论基础。

Gene engineering bacteria expressing human acetaldehyde dehydrogenase gene and its application

The invention discloses a gene engineering bacteria expressing the gene of human acetaldehyde dehydrogenase and its application, which belongs to the field of gene engineering and enzyme technology. The high expression of ALDH2 gene URA3 TPIp component Trp1L ALDH2 TPIt Trp1R is integrated into the genome of Saccharomyces cerevisiae W303 1A, compared with the free expression plasmid, to improve the stability of gene expression, and the constitutive promoter in the fermentation process did not induce the agent to join, product relatively safe. When 96h was fermented, the specific activity of acetaldehyde dehydrogenase was up to 0.97U/mg. The concentration of 250mg/100mL in ethanol production, acetaldehyde dehydrogenase enzyme activity reached 6.256U/mg, 3 in pH buffer, producing acetaldehyde dehydrogenase specific activity reached 0.301U/mg. The invention uses Saccharomyces cerevisiae as a host bacterium, on the one hand, maintains the activity of enzymes, and on the other hand improves the safety of products, providing a new way and theoretical basis for the development of antialcoholics.

【技术实现步骤摘要】
一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用
本专利技术涉及一种表达人源乙醛脱氢酶基因的基因工程菌及其应用，属于基因工程和酶

技术介绍
酒文化在我国有着悠久的历史，相当多的中国人有饮酒的爱好，然而长期饮酒、饮酒过度引发的健康问题也越来越受到人们的关注。人体中的乙醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)和乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10，Aldehydedehydrogenase)在乙醇的代谢中发挥着重要作用。乙醇在乙醇脱氢酶的作用下氧化成乙醛，之后在乙醛脱氢酶的作用下氧化成乙酸，当人体中两种酶能够充分表达，乙醇就会在短时间内充分代谢，减少酒精对中枢神经的影响。然而，一般情况下，乙醇脱氢酶可充分表达，缺乏乙醛脱氢酶的个体比较多，导致乙醛在体内大量积累，产生醉酒症状。在人体内，已经获得鉴定的乙醛脱氢酶基因共有12种，其中乙醛脱氢酶Ⅰ、乙醛脱氢酶Ⅱ、乙醛脱氢酶Ⅲ和乙醛脱氢酶Ⅳ是四种常见的类型。参与乙醛氧化的乙醛脱氢酶主要有两种，即与乙醛有最低Km值的线粒体乙醛脱氢酶Ⅱ和与乙醛有中等程度亲和力的胞浆乙醛脱氢酶Ⅰ，所以乙醛脱氢酶Ⅱ是人体酒精代谢的关键酶，近年来，随着人们对获得全新的、更有效的解酒保肝药物的需求日益迫切，关于乙醛脱氢酶Ⅱ编码基因ALDH2的研究工作更显其深远意义。基因的外源表达可以实现目的蛋白的高效表达。很多科研工作者将乙醛脱氢酶基因导入适宜的表达体系中，以构建高产乙醛脱氢酶的工程菌。2005年，裘丽珍在大肠杆菌BL21中实现了乙醛脱氢酶基因的异源高效表达，重组乙醛脱氢酶的比活达到331.7U/mg(参考文献：裘丽珍.人乙醛脱氢酶2基因的克隆及表达[D].浙江大学2005.)。2010年，黄锟等将乙醛脱氢酶基因导入毕赤酵母SMD1168中，分泌表达的重组乙醛脱氢酶的比活达到4.87U/mg(参考文献：黄锟等.人乙醛脱氢酶2基因在毕赤酵母SMD1168中的表达研究[J].中国医药生物技术,2010,5:10-48.)。现有技术中有多种对酶活的定义方式，因而造成了不同酶活定义下获得的重组酶比活差异明显，难以在同一水平下衡量重组菌的产酶能力。此外，大肠杆菌是一种致病菌，并且现如今报道的用毕赤酵母表达乙醛脱氢酶都需要用甲醇诱导，所以，大肠杆菌和毕赤酵母菌作为宿主菌对目的蛋白的安全性都有一定的影响，解酒药物的研究也受到了限制。
技术实现思路
为了解决现有技术中目的蛋白因为不能正确折叠而丧失一些功能，且在真核细胞中表达常需要诱导剂导致产品缺乏食品安全性的问题，本专利技术提供了一种人员的乙醛脱氢酶基因及生产该乙醛脱氢酶的酿酒酵母工程菌。本专利技术的第一个目的是提供一种人源的乙醛脱氢酶ALDH2基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供携带所述基因的载体或细胞系。本专利技术的第三个目的是提供一种酿酒酵母工程菌，是表达所述人源乙醛脱氢酶基因的酿酒酵母。在本专利技术的一种实施方式中，所述的酿酒酵母工程菌是以尿嘧啶营养缺陷型单倍体SaccharomycescerevisiaeW303-1A为宿主，表达SEQIDNO.1所示基因。本专利技术的第四个目的是提供构建所述酿酒酵母工程菌的方法，所述方法包括：(1)构建含SEQIDNO.1所示基因的基因表达组件：(2)将所述基因表达组件转化至酿酒酵母细胞中。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因表达组件按如下方法构建：(1)将SEQIDNO.1所示的序列与质粒pYX212连接，构建重组质粒pYX212-ALDH2,；(2)以pYX212-ALDH2为模板，构建含有Trp1基因启动子和终止子的基因片段TPIp-ALDH2-TPIt；(3)分别扩增Trp1基因的上游同源臂Trp1L和下游同源臂Trp1R，并将Trp1L、Trp1R、TPIp-ALDH2-TPIt片段以及URA3基因通过融合PCR连接，构建表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R。在本专利技术的一种实施方式中，所述的酿酒酵母是营养缺陷型酵母。在本专利技术的一种实施方式中，所述的酿酒酵母是SaccharomycescerevisiaeW303-1A。在本专利技术的一种实施方式中，所用的转化方法是电转化法。在本专利技术的一种实施方式中，所述电转化条件如下：电压：1.8kV，电容：25μF，电阻：186Ω。本专利技术的第五个目的是提供一种乙醛脱氢酶的生产方法，是将所述工程菌接种至YPD培养基中，28～30℃培养72～96h。本专利技术的第六个目的是提供所述基因在制备含乙醛脱氢酶的产品中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括发酵制备酒精饮品。本专利技术的第七个目的是提供一种可食性组合物，含有所述酿酒酵母工程菌的活性产物。在本专利技术的一种实施方式中，所述活性产物含有表达SEQIDNO.1所示基因获得的酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述活性产物为SEQIDNO.1所示基因编码的酶。本专利技术还要求保护应用所述酿酒酵母工程菌生产获得的酒精饮品。有益效果：本专利技术提供了一种可以高效表达人乙醛脱氢酶基因的工程菌以及构建方法，本专利技术的ALDH2基因高效表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R是整合到了酿酒酵母W303-1A的基因组上，与游离质粒表达相比，提高了基因表达的稳定性，不会使目的基因因为传代培养而丢失，并且采用的组成型启动子，在发酵过程中没有诱导剂的加入，产物相对来说比较安全。在发酵96h时，产乙醛脱氢酶的比活达到0.97U/mg。在250mg/100mL浓度的乙醇中，产乙醛脱氢酶的比酶活达到6.256U/mg，在pH3缓冲液中，产乙醛脱氢酶的比活达到0.301U/mg，具有较好的耐酸耐乙醇特性。本专利技术选用酿酒酵母作为宿主菌，一方面保持了酶的活性，另一方面提高了产品的安全性，为解酒药的研发提供了一条新的途径和理论基础。附图说明图1为ALDH2基因高效表达组件(Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R)的构建示意图；图2为阳性菌落的琼脂糖电泳检测；M，markerDL2000；1，阴性对照；2，阳性对照pUC57-ALDH2质粒PCR产物；3，阳性菌落的PCR产物；图3为重组质粒pYX212-ALDH2双酶切的琼脂糖电泳检测；M，markerDL10000；1，pYX212-ALDH2双酶切产物；图4为Trp1上、下游同源臂的PCR电泳图；M，markerDL2000；1-6，上游同源臂Trp1L的PCR扩增结果(269bp)；7-12，下游同源臂Trp1R的PCR扩增结果(255bp)；图5为URA3和TPIp-ALDH2-TPIt的PCR电泳图；M，markerDL10000；1-6，URA3的PCR扩增结果(1235bp)；7-12，TPIp-ALDH2-TPIt的PCR扩增结果(2614bp)；图6为ALDH2基因表达组件Trp1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-Trp1R融合的琼脂糖电泳检测；M，markerDL5000；1-3，表达组件融合的结果(4373bp)；图7为酵母转化子的PCR鉴定电泳图；M，MarkerDL5000；1，阴性对照；2，出发菌株PCR结果(600bp)；3，阳性对照pMD19-Trp1L-UR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA分子，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种DNA分子，其特征在于，含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.携带权利要求1所述DNA分子的载体或细胞系。3.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的DNA分子。4.根据权利要求3所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，以尿嘧啶营养缺陷型单倍体SaccharomycescerevisiaeW303-1A为宿主，表达SEQIDNO.1所示的基因。5.构建权利要求4所述酿酒酵母工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)构建含SEQIDNO.1所示基因的基因表达组件：(2)将所述基因表达组件转化至酿酒酵母细胞中。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列与质粒pYX212连接，构建重组质粒pYX212-ALDH2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆健，豆欣喜，吴殿辉，李晓敏，孙军勇，蔡国林，
申请(专利权)人：江南大学如皋食品生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32