淀粉酶的分离精制方法,所用的吸附剂及分离精制装置制造方法及图纸

具有分支链的多聚葡萄糖经分子间及／或分子内的交联处理得到的交联多聚葡萄糖，或葡萄糖的α－１，４结合均低聚物经分子间交联处理得到的交联均低聚物能选择性地吸附葡糖淀粉酶和β－淀粉酶，由于使用三元交联高分子物质，能将葡糖淀粉酶和β－淀粉酶极其有效地分离精制。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术提出淀粉酶的分离精制方法及其所用的吸附剂和分离精制装置，特别是关于用交联多聚葡糖或交联均低聚物高选择性的吸附葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶的淀粉酶分离精制方法及装置。现在，工业上是用α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶或β-淀粉酶对淀粉进行加水分解的方法生产葡萄糖、异构化糖和麦芽糖的。这样，葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶对于从淀粉中生产有用的低分子性甜味料，则非常有用。通常情况，酶是由生成酶的微生物、即酶的产生菌，经过液体培养制造的。作为研究用试剂的酶，是由盐析法和离子交换色谱电泳法相组合，通过复杂的分离精制过程，加以部分精制或高度精制而被应用。与此对比，工业用的酶制剂，则是由培养滤液不经任何处理而加以浓缩的浓缩液或其干燥的粉末，或者经过分离精制之后所得到的浓缩液或其干燥粉末而制取。但是，在培养滤液的浓缩液和粗干燥品中，由于含有培养液中所含有的多量令人讨厌的臭味成分和着色成分，所以在分离精制作为目的物的反应生成物时，最后必须要把这些成分除去。另外，在培养滤液中多半还都含有蛋白分解酶类。在除淀粉酶之外还含有蛋白分解酶类的培养滤液等的粗酶溶液中，于精制过程中及目的反应进行时，由于蛋白分解酶的作用，淀粉酶也常常被分解而失去活性，因此在利用淀粉酶等的酶反应生产有用物质时，就必须除去这些成为不利因素的不纯物质。这样，就给后续的反应生成物的分离精制工序增加了很大的负担。应用一般性的精制方法，如已知的盐析法和液体色谱法，只能限于作到部分浓缩，要想提高分离的精度，就须要改变一些操作条件，例如沉淀剂的种类、浓度、pH、充填剂的种类、吸附剂及解吸剂的种类，须要经过把这些条件加以组合搭配的复杂过程。不仅如此，操作中还须添加多量的作为沉淀剂或作为溶出剂的盐，而在进入到下一步工序时，还必须进行脱盐操作。此外，在这些个精制过程中还要产生盐浓度高达10%的BOD废液，这也须要进行处理，而且这一处理步骤相当复杂。鉴于以上原因，由这些复杂工序所构成的人们所熟知的精制方法，自然就被局限于专门进行研究用的试剂等方面了。尤其是对被认为难以精制的葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶，由于酶的起源不同，不同酶的分子构造也有所差异，尽管如此，如果开发出具有高选择性、高效性的吸附剂的话，便能够从培养滤液中将上述两种酶按同一等级进行高纯度的浓缩分离。本专利技术者们，着眼于早已知晓的、以直链淀粉为吸附剂的吸附法作为α-淀粉酶的精制方法(直链淀粉一是葡萄糖的直链状聚合物，分子量10～40万，葡萄糖聚合数为5×102～2×103)，并将这种方法试用于葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶的精制。但是，与精制α-淀粉酶相比较，其吸附容量只有千分之一以下，非常之低，很显然，以淀粉作为吸附剂的这种众所周知的方法，对于葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶的精制是没有实用意义的。本专利技术之目的是提供从除葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶之外还含有多种多样不纯物的酶含有液中，对作为目的物的淀粉酶具有高选择性、高吸附性的吸附剂。本专利技术之其它目的是提供在和葡萄糖淀粉酶或β-淀粉酶的水溶液接触之后，就和这些淀粉酶形成复合体而变为不溶于水的凝胶，从而能非常容易地分离精制葡萄糖淀粉酶或β-淀粉酶的吸附剂。本专利技术之再其它目的是提供具有高选择性、能高效性吸附分离葡萄糖淀粉酶或β-淀粉酶的新规交联多聚葡萄糖和新规交联均低聚物。本专利技术之再其它目的是提供交联多聚葡糖及交联均低聚物的制造方法。本专利技术之再其它目的是提供从除葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶之外尚含有多种多样不纯物的酶含有液中，为了高选择性高效性的吸附分离目的淀粉酶而用交联多聚葡糖或交联均低聚物分离精制淀粉酶的方法。本专利技术之再其它目的是提供使对葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶两者之一或两者进行选择性吸附的新规吸附剂和酶含有液相接触，根据目的的不同，吸附分离两种酶中的一种或两者的淀粉酶的分离精制方法。本专利技术之再其它目的提供使吸附剂吸附的葡萄糖淀粉酶及β-淀粉酶容易解吸的方法。本专利技术之再其它目的是提供具有高选择性高效性地吸附分离葡萄糖淀粉酶及β-淀粉酶的淀粉酶分离精制装置。本专利技术的再其它目的和优点，阅读以下记载便可明了。本专利技术的第一方面是通过使具有分支链的多聚葡糖的分子间和/或分子内交联化，得到三元交联高分子物质(交联多聚葡糖)。本专利技术的第二方面是通过使葡萄糖的α-1，4结合的均低聚物的分子间交联化，得到三元交联高分子物质(交联均低聚物)。本专利技术的第三方面是以包括三项工序为特征的淀粉酶的分离精制方法。第一项工序是使含有葡萄糖淀粉酶及β-淀粉酶中的一种或两者的粗酶水溶液，与有分支链的多聚葡糖经分子间和/或分子内交联化所得到的三元高分子物质、或与将葡萄糖的α-1，4结合的均低聚物经分子间交联化所得到的三元交联高分子物质的任何一种或两者相接触，吸附葡萄糖淀粉酶及β-淀粉酶中的一种或两者。第二项工序是把已吸附酶的三元交联高分子物质的水合凝胶与液体加以分离。第三项工序是使该水合凝胶和弱碱性水溶液，0.5M以上浓度的盐水溶液以及弱碱性并含有盐的水溶液中的任何一种相接触，以使吸附的酶解吸。本专利技术的第四方面是有分支链的多聚葡糖或葡萄糖的α-1，4结合的均低聚物，在60℃下对水的溶解度至0.01%以下为止的交联处理交联多聚葡糖或交联均低聚物的制造方法。本专利技术的第五方面是淀粉酶的分离精制装置。该装置的特征是由两个槽相连结所构成，一个是为了使含有葡萄糖淀粉酶和β-淀粉酶之一或两者的粗酶水溶液进入的菌体去除培养液贮槽;另一个是为了使有分支链的多聚葡糖进行分子间和/或分子内交联化得到的交联多聚葡糖或葡萄糖的α-1，4结合的均低聚物与粗酶水溶液接触的淀粉酶吸附槽。图例的简单说明第1图示出应用交联剂表囟醇(epihalogenhydrin)所得之交联多聚葡糖的代表性构造单位的例子。第2图和第3图示出应用交联剂表囟醇。所得之交联均低聚物的代表性构造单位的例子。第4图示出分离精制葡萄糖淀粉酶或β-淀粉酶使用的装置;用悬浮混合方法使吸附剂和菌体去除培养液相接触的装置。第5图示出用充填柱使吸附剂和菌体去除培养液相接触进行淀粉酶分离精制的装置。图6图示出用流动曾使吸附剂和菌体去除培养液相接触进行淀粉酶分离精制的装置。图例的详细说明以下展示本专利技术所用之理想的吸附剂。(a)葡萄糖-是在由α-1，4-结合而聚合的主链上，以非还元性葡萄糖残基作为开放末端，而且具有由葡萄糖α-1，4结合而聚合的分支链的分支多聚葡糖;是以相当于分支点的支链中的葡萄糖残基占分子中全葡萄糖残基数的5%以上的分支度，由α-1，6结合而分支的分支多聚葡糖进行分子间和/或分子内交联化所获得的三元交联高分子物质(交联多聚葡糖)。分支链的平均聚合度为2～50，以2～20为好。将表囟醇(epihalgenhydrin)作为交联剂使用的该物质的代表性构造单位的例子，示于第1图。(b)交联化前的(a)所记载的分支多聚葡糖，在淀粉酶类、特别是葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶的作用下，使分支链的葡萄糖的平均聚合度在2以上6以下，用这种短链化的分支多聚葡糖的交联化所得到的三元交联高分子物质(交联多聚葡糖)。在第1图中，这样的交联多聚葡糖，e及f相当于0～4。(c)葡萄糖分子为2～50，通过α-1，4结合，使直线状聚合的均低聚物进行分子间交联化所获得的三元高分子物质(交联均低聚物)。将表囟醇作本文档来自技高网...

【技术保护点】
淀粉酶的分离精制方法，其特征是该方法包括以下工序：将含有葡糖淀粉酶及β－淀粉酶中一方或两方的粗酶水溶液，与具有分支链的多聚葡萄糖通过分子间和／及分子内交联化而得到的、或葡萄糖的ｘ－１，４结合均低聚物经过分子间交联化而得到的三元交联高分子 物质的任何一方或两方接触，并使葡糖淀粉和β淀粉酶的一方或两方被吸附的工序；将吸附有酶的三元交联高分子物质的水合凝胶与液体分离的工序；以及使该水合凝胶与弱碱性水溶液，０．５Ｍ以上浓度的盐水溶液以及弱碱性且含有盐的水溶液中任何一种水溶液 接触，并使吸附的酶解吸的工序。

【技术特征摘要】
JP 1986-10-6 236147/861.淀粉酶的分离精制方法，其特征是该方法包括以下工序将含有葡糖淀粉酶及β-淀粉酶中一方或两方的粗酶水溶液，与具有分支链的多聚葡萄糖通过分子间和/及分子内交联化而得到的、或葡萄糖的α-1，4结合均低聚物经过分子间交联化而得到的三元交联高分子物质的任何一方或两方接触，并使葡糖淀粉和β淀粉酶的一方或两方被吸附的工序；将吸附有酶的三元交联高分子物质的水合凝胶与液体分离的工序；以及使该水合凝胶与弱碱性水溶液，0.5M以上浓度的盐水溶液以及弱碱性且含有盐的水溶液中任何一种水溶液接触，并使吸附的酶解吸的工序。2.权利要求1记载的淀粉酶的分离精制方法，其特征是，上述三元交联高分子物质经过交联处理使其对水的溶解度在60℃时为0.01%以下。3.权利要求1记载的淀粉酶的分离精制方法，其特征是上述均低聚物的聚合度为2～50。4.权利要求1记载的淀粉酶的分离精制方法，其特征是，三元交联高分子物质是具有分支链的多聚葡萄糖预先用淀粉酶处理并使分支链短链化，然后经分子间和/或分子内交联而得到的三元交联高分子物质。5.权利要求4记载的淀粉酶的分离精制方法，其中，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶，α-淀粉酶中至少一种用作淀粉酶。6.权利要求1记载的淀粉酶的分离精制方法，其中，具有分支链的多聚葡萄糖是在葡萄糖由β-1，4-结合而聚合的主链上，以非还原性葡萄糖残基作为开放末端，且具有由葡萄糖α1，4结合而聚合的分支链的分支多聚葡萄糖，该分支链以相当于分支点的主链中的葡萄糖残基占分子中葡萄糖残基总数的5%以上的分支度通过α-1，6结合而分支的分支多聚葡萄糖。7.β-淀粉酶及葡糖淀粉酶的分离精制方法，该方法包括以下工序将含有α淀粉酶、β-淀粉酶及葡糖淀粉酶的粗酶水溶液、与葡萄糖的聚合度为4～50且具有分支链的分支多聚葡萄糖经分子间及/或分子内交联化得到的交联多聚葡萄糖或平均聚合度4～50的葡萄糖的α-1，4-结合均低聚物接触，并选择性地吸附β-淀粉酶和葡糖淀粉酶的工序;将吸附有β-淀粉酶和葡糖淀粉酶的交联多聚葡萄糖或交联均低聚物的水合凝胶和液体分离的工序;以及将该水合凝胶和弱碱性水溶液，0.5M以上浓度的盐水溶液及弱碱性且含有盐的水溶液中的任何一种水溶液接触，使吸附的β-淀粉酶和葡糖淀粉解吸的工序。8.权利要求7记载的分离精制方法，其中，使用了葡萄糖的聚合度为4～20且具有分支链的分支多聚葡萄糖经分子间及/或分子内交联化得到的交联多聚葡萄糖或平均聚合度为4～20的葡萄糖的α-1，4结合均低聚物经分子间交联得到的交联均低聚物。9.权利要求7记载的分离精制方法，其中，交联多聚葡萄糖是将分支度为5～35%的糖原或支链淀粉交联化而制得的。10.权利要求7记载的分离精制方法，其中，交联均低聚物是将麦芽四糖或麦芽六糖交联化而得到的。11.权利要求7记载的分离精制方法，其中还包括将分离精制得到的β-淀粉酶及葡糖淀粉酶的水溶液，与葡萄糖的平均聚合度2～4以下且具有分支链的多聚葡萄糖经分子间及/或分子内交联化得到的交联多聚葡萄糖或平均聚合度2～4以下的葡萄糖的α-1，4结合均低聚物接触，并选择性地吸附葡糖淀粉酶，使葡糖淀粉酶分离的工序。12.葡糖淀粉酶的分离精制方法，该方法包括以下工序将含有α-淀粉酶，β-淀粉酶及葡糖淀粉酶的粗酶水溶液，与葡萄糖的平均聚合度为2～6且具有分支链的分支多聚葡萄糖经分子间及/或分子内交联化得到的交联多聚葡萄糖或平均聚合度2～6的葡萄糖的α-1，4-结合均低聚物经分子间交联化得到的交联均低聚物接触，并选择性吸附葡糖淀粉酶的工序;将吸附了葡糖淀粉酶的交联多聚葡萄糖或交联均低聚物的水合凝胶和液体分离的工序;以及将该水合凝胶，与弱碱性水溶液、0.5M以上浓度的盐水溶液以及弱碱性且含盐的水溶液中任何一种水溶液接触，并使吸附的葡糖淀粉酶解吸的工序。13.根据权利要求12的分离精制方法，其中，使用的是葡萄糖平均聚合度为2～4以下且具有分支链的分支多聚葡萄糖经分子间及/或分子内交联得到的交联多聚葡萄糖或平均聚合度2～4以下的葡萄糖的α-1，4-结合均低聚物经分子间交联得到的交联均低聚物。14.权利要求12记载的分离精制方法，其中，交联多聚葡萄糖是，预先用淀粉酶处理分支多聚葡萄糖且使分支链的平均聚合度短链化至2～6，然后在分子间及/或分子内交联化而得到的。15.权利要求12记载的分离精制方法，其中，交联均低聚物是将麦芽糖或麦芽三糖交联化而得到的。16.权利要求12记载的分离精制方法，该方法还包括在使葡糖淀粉酶被吸附工序后，将含有得到的α-淀粉酶和β-淀粉酶的残留粗酶水溶液，与葡萄糖平均聚合度，为4～20且具有分支链的分支多聚葡萄糖经分子间及/或分子内交联化得到的交联多聚葡萄糖或平均聚合度为4～20的葡萄糖的α-1，4-结合均低聚物经分子间交联化得到的交联均低聚物接触，并仅仅使β-淀粉酶被吸附，将β-淀粉酶分离精制的工序。17.β-淀粉酶及葡糖淀粉酶的分离精制方法，该方法包括以下工序将含有β-淀粉酶及葡糖淀粉酶的粗酶水溶液、与葡萄糖的平均聚合度为4～20且具有分支链的分支多聚葡萄糖经分子间及/或分子内交联化得到的交联多聚葡萄糖或平均聚合度4～20的葡萄糖的α-1，4-结合均低聚物经分子间交联化得到的交联均低聚物接触，并选择性地吸附β-淀粉酶和葡糖淀粉酶两者的工序;将吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：石田昌彦，芳贺良一，西村勇作，佐藤雅美，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]