微生物生产L-抗坏血酸的方法及其发酵培养物技术

本发明专利技术公开了由微生物生产Ｌ－抗坏血酸的方法，此方法包括在ｐＨ低于约６．０的发酵培养基中培养选自由Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属生物体和Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ种生物体所组成的组中的生物体。此方法进一步包括从发酵培养基中回收Ｌ－抗坏血酸。所公开方法的最主要的优点在于产生了高浓度的胞外Ｌ－抗坏血酸，并在该公开的方法的ｐＨ下，不会发生因氧化作用所致的胞外Ｌ－抗坏血酸的显著降解。Ｌ－抗坏血酸有许多已知的用途，如可用作维生素补充剂。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及由微型藻类生产L-抗坏血酸(维生素C)。具体地说，本专利技术涉及微型藻类在低pH下(2.5-6.0)生产L-抗坏血酸的方法。L-抗坏血酸(维生素C)是植物和动物界中广泛分布的水溶性维生素。可从如红辣椒、唐菖蒲叶、蔷薇果、柿子和柠檬果的植物源中提取L-抗坏血酸(L-AA)，也可以从L-木糖，L-半乳糖或D-葡萄糖合成L-AA。F.A.Loewus，L-Ascorbic AcidMetabolism Biosynthesis、Function，in TheBiochemistry of plants.Vol.3，Academic Press，New York，1980，PP.77-99中提到L-抗坏血酸的生物合成和来源。尽管大多数动物种类都可合成L-抗坏血酸，但人类和其他灵等类、豚鼠、食果蝙蝠、一些鸟类及例如Coho鲑、虹鳟和鲤鱼的鱼类却不能合成L-抗坏血酸。这些动物需要饮食来源的L-抗坏血酸以防止坏血病。鱼类的L-抗坏血酸缺乏会导致背柱侧凸、背柱前凸、增重减缓、对细菌感染的敏感性增强、皮肤颜色变黑、鳍糜烂以及软骨性骨的形成减慢。L-抗坏血酸是大用量的化合物，它需要经济而有效的生产方法。多种藻类可生产L-抗坏血酸。由于碳源的利用低，酸仅以低浓度产生，由此微型藻类生产L-抗坏血酸还不是一种有用的大量生产方法。Skatmd在美国专利5,001,059中描述了使用Chlorella Pyrenoidosa微型藻类以高产量形成L-抗坏血酸的方法。由于L-抗坏血酸的浓度和碳源的利用已显著改善，此方法成为微型藻类的L-抗坏血酸生产中的一种显著改善的方法。然而，在持续生产L-抗坏血酸所必需的相对高的pH(6.5-7)下，胞外酸容易被细胞代谢和L-抗坏血酸生产所必需的空气氧化。对在低pH(低于6.5)下生产L-抗坏血酸的有效的微型藻类方法的需求仍存在。本专利技术针对的是生产L-抗坏血酸的方法，此方法包括在pH低于约6.0的发酵液中培养选自由Prototheca属生物体和Chlorella protothecoides种生物体组成的组中的生物体。此方法进一步包括从发酵培养基中回收L-抗坏血酸。可选择的实施方案包括在含有可利用氧源的发酵培养基中培养上文所述的生物体，并从发酵培养基中回收L-抗坏血酸以生产L-抗坏血酸的方法，其中发酵培养基包括胞外L-抗坏血酸。较优选的生物体是Prototheca属的生物体，特别优选的生物体是Prototheca moriformis和Prototheca zopfii种的生物体。本专利技术方法特别有利的原因是它可导致生产出高浓度的胞外L-抗坏血酸，从而使得L-抗坏血酸的回收比假如大多数L-抗坏血酸被分散在细胞内的情况下的回收更加简单。本专利技术方法可在可利用的氧源存在下进行， 因为在本专利技术方法的pH条件下，所生产的胞外L-抗坏血酸的降解不显著。胞外L-抗坏血酸的回收可通过多种方法实现，包括离子交换、层析法、抽提、膜分离，反相渗透、蒸馏、化学衍生化方法和结晶作用。此方法可另外包括胞内L-抗坏血酸的回收。在一个实施方案中，从发酵液中除去细胞，从无细胞的发酵液中回收胞外L-抗坏血酸以及从分离的细胞中回收L-抗坏血酸。本专利技术的另一方面包括发酵培养物，它含有生产L-抗坏血酸的微型藻类和发酵培养基。在此实施方案中，发酵培养基包括胞外L-抗坏血酸，并具有可利用的氧源。在发酵培养物的较优选的实施方案中，微型藻类选自由Prototheca属生物体和Chlorella protothecoides种生物体所组成的组。另外，发酵培养物的较优选的实施方案包括pH约低于6的发酵培养物，更优选的低于5.5，进一步优选低于约5.0。微生物用于在低pH下生产L-抗坏血酸的较优选的微生物是Prototheca属，尤其是Prototheca zopfii和Prototheca moriformis种的微型藻类以及Chlorella protothecoides种的微型藻类。此方法已被下列生物体阐明Prototheca zopfii BTR 1254株，Prototheca moriformis BTR 1385株(ATCC75669)，Chlorella protothecoides BTR 902(ATCC 75667)。Prototheca zopfiiUTEX 1438株能在高pH下生产L-抗坏血酸，也能在低pH下生产L-抗坏血酸。Prototheca zopfii UTEX 1438株得自藻类培养物保藏中心(Departmentof Botany，University of Texas at Austin，Austin，Texas 78713-7640，USA)。因目前每种仅$25.00的低廉售价，培养物对公众而言是可以使用的。Prototheca zopfii BTR 1254株，Prototheca moriformis BTR 1385株和Chlorellaprotothecoides BTR 902株选自野生型。Prototheca moriformis BTR 1385株(ATCC 75669)和Chlorella protothecoides BTR 902(ATCC 75667)于1994年2月9日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive Rockville，MD 20852，USA.培养基培养基包括碳源、多种盐和一般还包括痕量矿物质。碳源可以是适于本专利技术的微生物发酵的任何碳源。尤其是，碳源可选自乙醇、甘油和葡萄糖，并优选为葡萄糖。葡萄糖源可以是葡萄糖或可在原位转化为葡萄糖的任何糖类，如糖蜜、玉米糖蜜等。为了最适地促进，而不抑制或不恰当地限制细胞生长，可在发酵罐中使用非抑制/非限制量的葡萄糖源。尽管葡萄糖源的最适浓度随生物体的不同而有所不同，但通过试验可容易地确定。维持葡萄源在5-30g/L范围的按时加入在正常情况下足以促进细胞生长而避免葡萄糖的抑制作用。按需要，其他添加物可随葡萄糖源一起在最初加入，也可连续加入到培养基中以维持它们的浓度。它们包括碱性金属磷酸盐，例如磷酸钠和钾，尤其如磷酸氢二钠和磷酸二氢钾。磷酸氢二钠的总量典型地为约1-2总g/L，优选为1-1.5总g/L，更优选的为1.3总g/L。起初加到发酵罐中的磷酸氢二钠的量典型地约为所加入磷酸氢二钠总量的35-50％，更典型地约为40-45％。磷酸二氢钾的总量通常为约1.5-3g/L，更通常地约为2-2.5g/L。起初加入的量通常为总量的40-50％，更通常地约为45-50％。生物学可接受的螯合剂，如柠檬酸三钠最好以约为0.8-1.2g/L，通常约为1.0g/L的总量加入。生物学可接受的矿物酸被加入以维持溶液中的痕量金属并中和通常用作氮源的氨。为方便起见，可使用约为1-2mL/L，典型地约为1.2-1.5mL/L的浓硫酸。加入约为0.1-0.2g/L，优选约为0.1-0.15g/L的镁以作为生理学上可接受的盐、如硫酸盐。由于铁和铜可加速胞外L-抗坏血酸的降解，从而抑制其在培养基中的积累，故应限制所使用的这些金属的量。最初加入的铁(+2)约为2-5mg/L，优选约为3-4mg/L，在任何随本文档来自技高网...

【技术保护点】
生产Ｌ－抗坏血酸的方法，此方法包括：（ａ）在ｐＨ低于约６．０的发酵培养基中培养选自由＊＊＊属生物体和＊＊＊种生物体组成的组中的生物体；和（ｂ）从所说发酵培养基中回收Ｌ－抗坏血酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗纳德J赫斯，杰弗里A朗宁，托马斯J斯卡特拉德，
申请(专利权)人：以生物技术资源的名义经营的DCV公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]