用于制备抗坏血酸、2-酮-L-古洛糖酸及2-酮-L-古洛糖酸酯的酶促方法技术

本发明专利技术的目的在于用于制备抗坏血酸、２－酮－Ｌ－古洛糖酸及２－酮－Ｌ－古洛糖酸酯的有效、高产的方法。该方法包括将合适的起始原料与水解酶催化剂、比如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶反应。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于制备抗坏血酸、2-酮(keto)-L-古洛糖酸(KLG)和KLG的酯的方法。更具体地说，本专利技术涉及酶催化剂在制备抗坏血酸、KLG或KLG的酯中的用途。
技术介绍
抗坏血酸、又名维生素C是一种必须存在于人类饮食中以预防坏血病并且已经鉴定为可以提高对传染的抗性的试剂的饮食因子。在商业方面，抗坏血酸例如用作营养添加物、固色剂、肉类和其它食品中的调味剂和防腐剂、面包生面团中的氧化剂、收获中的柑橘类水果的切除(abscission)以及分析化学中的还原剂。一种用于制备抗坏血酸的通用方法使用了原始Reichstein-Grossner合成的改进方法(Reichstein等，Helv.Chim.Acta,17:311(1934)；Reichstein的美国专利2,301,811；本文中所引用的所有文献逐一插入本文仅供参考)。在该方法中把葡萄糖源转化成抗坏血酸。在转化过程中生成了KLG的双丙酮化合物的中间体。有几种两阶段方法用于制备抗坏血酸。在第一阶段中，通过发酵方法将葡萄糖或者转化为分离了的KLG的中间体(Sonoyama等，应用与环境微生物学，43:1064-1069(1982)；Anderson等，科学，230:144-149(1985)；Shinjoh等，应用与环境微生物学，61:413-420(1995))或者转化为Reichstein-Grossner合成的中间体、即KLG的双丙酮化合物。把上述两种中间体之一转化为抗坏血酸的第二阶段是通过两条已经报道的路线中的一条路线进行的。第一条路线、即Reichstein-Grossner合成的后继步骤的改进需要多个步骤，由此在强酸条件下使中间体与甲醇发生酯化以生成甲基-2-酮-L-古洛糖酸(MeKLG)。然后使MeKLG与碱反应以生成金属抗坏血酸盐。最后，用酸化剂处理金属抗坏血酸盐以得到抗坏血酸。第二条路线为一步法，该方法包括如最初在Reichstein的英国专利466548中公开、随后由Yamazaki改进(Yamazaki，日本农业化学协会杂志，28:890-894(1954)与化学文摘，50:5992d)并且再由Yodice改进(WO87/00839)的酸催化KLG的成环。Yodice的方法在商业上不受欢迎，因为它使用了大量的气态氯化氢、需要非常昂贵的加工设备并且生产出需要进一步纯化的抗坏血酸产品。脂肪酶、即一组水解酶已经成功地用于一些有机酸酯的合成中。具体说来，脂肪酶已经用于其中的酯化剂为不可逆的醇的酯基转移作用，比如当醋酸乙烯酯用作酯化剂时(Ihiel，今日催化，517-536(1994))。Gutman等(四面体通讯，28:3861-3864(1987))描述了一种使用猪胰脂肪酶作为催化剂由γ-羟甲基酯制备简单的5-元环内酯的方法。但是，Gutman等(四面体通讯，28:5367-5368(1987))随后报道了用δ-羟甲基酯代替γ-羟甲基酯并且使用同样的催化剂仅生产出聚合物。在Sakashita等的EP0 515 694 A1中，抗坏血酸酯的合成(在伯羟基上进行酰化)包括在有脂肪酶存在的条件下在极性有机溶剂中使抗坏血酸与多种脂肪酸的活性酯(即脂肪酸乙烯酯)反应。因此，在现有技术中需要有生产下列物质的方法(a)由KLG或KLG的酯生产抗坏血酸或其金属盐，(b)由KLG的酯生产KLG和(c)由KLG生产KLG的酯，所述方法具有高产率和高纯度、极少或者没有副产物产生并且在温和的条件下进行。因此，本专利技术主要的目的在于提供上述方法。专利技术概述本专利技术公开了在化学和生物学领域中的进步，其中用于制备抗坏血酸的方法包括使KLG或KLG的酯与水解酶催化剂接触。在本专利技术的另一个实施方案中，用于生产KLG的方法包括在水溶液中使KLG的酯与水解酶催化剂接触。在本专利技术的再一个实施方案中，用于由KLG生产KLG酯的方法包括使KLG的醇溶液与水解酶催化剂接触。醇溶液含有与将要制得的KLG酯的烷基部分相对应的醇。在本专利技术的再一个实施方案中，用于由KLG的酯生产KLG的酯的方法包括使第一种KLG酯的醇溶液与水解酶催化剂接触。该醇溶液含有与将要制得的第二种KLG酯的烷基部分相对应的醇。专利技术详述本专利技术的目的在于出乎意料地发现使用水解酶作为催化剂通过诱导KLG或KLG酯的闭环，可以由KLG、或者更优选地可以由KLG的酯生成抗坏血酸。可以在熔化状态或者在溶液中进行用于生产抗坏血酸的方法。该方法也可以在体内或在体外进行。对体内方法而言，水解酶催化剂可以天然存在于宿主细胞中或者可以通过重组DNA方法引入到宿主细胞或者生物体中。本专利技术的目的还在于出乎意料地发现KLG可以在可逆反应中通过在水溶液中使用水解酶作为催化剂使KLG的酯发生反应来制备。此外，本专利技术的目的在于出乎意料地发现KLG的酯可以通过使用水解酶作为催化剂在醇溶液中使KLG或另一种KLG的酯发生反应来制备。用于制备上述溶液的醇对应于将要制得的KLG的酯的烷基部分。在本专利技术的方法中用作催化剂的水解酶可以从任何来源适宜的生物体中得到或者分离出来。其中包括的实例有、但却不限于植物、微生物以及动物，比如酵母、细菌、霉菌、真菌、鸟类、爬行动物、鱼类和哺乳动物。正如在酶命名(学术出版社，1992)中规定的那样，对本专利技术而言的水解酶通常被定义为E.C.3.-.-.-的酶类，并且这些酶可以通过商业途径得到。优选的水解酶为那些能够影响含有羰基或者磷酸基团的分子水解的酶。更具体地说，优选的水解酶为能够影响在含有一个杂原子单键的羰基碳上发生水解的酶。这些含有一个杂原子单键的羰基碳的实例包括、但却不限于酯、硫酯、酰胺、酸、酰基卤及类似物。优选的水解酶包括E.C.3.1.-.-的酶类，它包括作用于酯键的水解酶、比如酯酶和脂肪酶；E.C.3.2-.-的酶类，它包括糖苷酶；E.C.3.4-.-的酶类，它包括肽的水解酶，比如蛋白酶；以及E.C.3.5.-.-的酶类，它包括作用于除肽键以外的键的酰胺酶。最优选的水解酶包括蛋白酶、酰胺酶、脂肪酶和酯酶。最优选的水解酶含有活性位点的丝氨酸残基，它能够与KLG或KLG的酯进行酯化或者酯基转移作用。甚至更为优选的为那些含有丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的催化三联体的水解酶。优选的蛋白酶包括那些来源于芽胞杆菌属或曲霉属细菌的蛋白酶。特别优选的蛋白酶为那些从地衣形芽胞杆菌细菌中得到的蛋白酶。优选的蛋白酶为那些与枯草蛋白酶之间至少具有70％的序列同源性的蛋白酶。与枯草蛋白酶具有序列同源性的蛋白酶用于洗涤剂工业中，因此可以方便地得到。更优选的为与枯草蛋白酶之间至少具有80％序列同源性的蛋白酶，甚至更为优选的为与枯草蛋白酶之间至少具有90％序列同源性的蛋白酶，特别是与枯草蛋白酶之间至少具有95％序列同源性的蛋白酶。一种非常优选的蛋白酶为枯草蛋白酶自身，它具有由Smith等在《生物化学杂志》243:2184-2191(1968)中所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)并且如下所示MMRKKSFWLGMLTAFMLVFTMAFSDSASAAQPAKNVEKDYIVGFKSGVKTASVKKDIIKESGGKVDKQFRIINAAKAKLDKEALKEVKNDPDVAYVEEDHVAHALAQTVPYGIPLIKADK本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备抗坏血酸的方法，该方法包括将选自由２－酮（ｋｅｔｏ）－Ｌ－古洛糖酸和２－酮（ｋｅｔｏ）－Ｌ－古洛糖酸酯组成的组中的化合物与水解酶催化剂接触以生成抗坏血酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JC胡布斯，
申请(专利权)人：伊斯曼化学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]