2-酮基-L-古洛糖酸的改良性生产方法技术

一种生产２－酮基－Ｌ－古洛糖酸（以下简称２ＫＧＡ）的方法，该方法包括： （１）在含有能生成２ＫＧＡ底物的液体培养基中培养能由Ｌ－山梨糖生成２ＫＧＡ的微生物， （２）在回收培养液中微生物的同时，回收所生成的２ＫＧＡ， （３）把所回收的微生物接种到新的液体培养基中以用于下面的培养和 （４）重复上述培养并至少再回收一次。 本发明专利技术提供了一种生产２ＫＧＡ的工业可行性通用方法，该方法减少了细胞增殖和种子培养时间，并且减少了起始培养基材料用量和培养废物的量。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种生产2-酮基-L-古洛糖酸(以下简称2KGA)的改良性方法，其包括(1)在含有能生成2KGA的底物的液体培养基中，培养一种具有由L-山梨糖生成2KGA能力的微生物;(2)在回培养液中微生物的同时，回收所生成的2KGA;(3)将所回收的微生物接种到一种新的液体培养基中以用于下面的培养和(4)重复上述培养并至少再回收一次，以便能缩短下一次培养的时间和提高生产效率。本专利技术适用于由各种各样的底物生成2KGA的微生物细胞反应(包括发酵)。本专利技术的方法有利于应用在2KGA的工业化生产中，而2KGA则是利用微生物合成L-抗坏血酸的一种有用的中间体。尽管人们对改善通过微生物细胞反应生产有价值物质的产率有过多种尝试，但是目前尚没有能极显著地减少起始培养基材料用量及培养废物量、缩短培养操作时间且设备简单宜行的工业可行性细胞反应方法和发酵方法。从传统上讲，作为L-抗坏血酸合成的一种有用中间体的2KGA，过去一直是用工业上通用的称为赖克斯坦(Reichstein)方法(见Helvetica Chimica Acta，Vol.17，P.311，1934)的工艺来生产的。然而，由于其步骤繁多且要使用大量的有机溶剂，对现代化工业技术来说，该方法是不能令人满意的。人们也提出了一些替代赖克斯坦方法的方法，主要是一些利用微生物的方法，包括以下的方法利用微生物把D-葡萄糖氧化成2，5-双酮基葡糖酸，然后经过微生物或化学反应将其还原成2KGA的方法(见日本专利申请公告公报Nos.14493/1964，25033/1978，15877/1981和35920/1984)，将棒状杆菌属细菌2，5-双酮基-D-葡糖酸还原酶基因引入到能根据DNA重组技术生成2，5-双酮基-D-葡糖酸的欧文氏菌属细菌中，以通过一步性发酵过程由D-葡萄糖得到2KGA的方法(科学，230卷，144页，1985年)，和利用葡糖杆菌属细菌氧化作为起始物质的D-山梨糖醇或L-山梨糖以生产2KGA的方法(见日本专利申请公开公报No.150287/1990)。还有另一个已知的方法，即利用分离自土壤中的假葡糖杆菌属细菌把L-山梨糖有效地转化为2KGA(见日本专利申请公开公报No.228288/1987)。另外，欧洲专利申请公开No.221707(日本专利申请公告公报No.85088/1989)还公开了一种由L-山梨糖生产2KGA的更有效的方法，同样是使用上述假葡糖杆菌属细菌进行，其依据是，通过上述微生物所进行的2KGA生产会因在培养基中添加稀土元素而得到明显的促进。在上述已知的生产2KGA的方法中，都使用了称做批量培养的普通培养方法。具体地说，在培养初始时在培养基中同时加入底物糖或糖醇，或者在培养期间半连续或连续地将底物的一部分或全部加入到培养基中，当足够的2KGA富集时则停止培养，而即使继续进行培养2KGA的有效性转化亦不再发生，这样即得到培养液。在其后过程中从培养体系中除去的细胞通常是废弃不同的;下一轮培养开始于种子培养。不过，这些方法在每一轮培养中都需要种子培养，因在主培养过程中微生物增殖或生长的需求通常使用致密性培养基。从工业生产的角度看这些都是不经济的。另外，在培养完成后分离所需产物中产生大量的培养废物，从环境保护的角度看也是不适宜的。另外，由于经种子培养得到的种子的主培养物的接种量较小，在主培养过程中使微生物增殖到所需的细胞数量则要花费很多的时间，因而也就延长了主培养过程所需的时间。作为解决这些问题的方法，人们已经提出了固相细胞方法和固相酶方法，其中所需反应中所涉及的微生物细胞或酶被固定在一个载体上。不过，这些方法全都需要尽很大努力才能达到微生物细胞或酶的满意固定或保持其活性。近年来，人们又开发出了生物反应器，其可以利用发酵罐和滤膜的结合进行培养。然而生物反应器也有一些缺陷，包括设备复杂及一般性操作困难，需要高成本及复杂技术以防止微生物对设备的污染。本专利技术的目的就在于提供一种工业可行性方法，其适用于2KGA生产的各种各样的培养或微生物细胞反应，亦可以用简便宜行的设备极大地减少起始培养基材料用量及培养废物量并缩短培养所需时间。按照这个思路，本专利技术人在寻求一种微生物细胞反应的更有利的方法上进行了一系列改良尝试。专利技术人尝试了一种2KGA发酵方法，其中使微生物细胞在单次培养中生长以获得所需产物2KGA(其存在于培养液或微生物细胞反应液的含水部分)，之后具有剩余活性的细胞再用于下一次的2KGA发酵，而不是做废料处理掉。结果专利技术人发现，使用重复循环培养方法，与普通批量培养和其它方法相比较，对于同样量被氧化的底物来说，有可能显著缩短发酵时间和减少起始培养基材料的用量和培养废物的量，其中如此获得的细胞的一部分或全部被用于下一次的培养，优选的是加入一种活性保持助剂。因此，本专利技术涉及一种生产2-酮基-L-古洛糖酸(以下简称2KGA)的方法，该方法包括(1)在含有能产生2KGA的底物的液体培养基中，培养一种具有由L-山梨糖生成2KGA的微生物和(2)在回收培养液中微生物的同时，回收所产生的2KGA，(3)将回收的微生物接种到一种新的液体培养基中以用于下面的培养和(4)重复上述培养并至少再回收一次。具体地说，本专利技术包括一种生产2KGA的方法，该方法包括主要通过使用至少一种能产生2KGA的微生物进行培养或微生物细胞反应，其中细胞在保持其必要活性的情况下被重复使用两次或更多次，与此同时或其后所产生的2KGA被分离并回收。这里，培养或微生物细胞反应可以是这样一种反应，其中对具有所需生产能力的微生物加以培养或另行处理以得到足够数量的细胞，然后使这些细胞与底物接触，在细胞与底物接触时可以有或没有细胞增殖。微生物细胞反应也可以通过一种普通培养方法来进行，其中经小规模种子培养而得到的种子被转移到主培养基中，以产生具有细胞增殖的所需产物，特别是在第一次中培养更是如此。更具体地说，本专利技术涉及一种培养方法，其中在进行培养和产生2KGA之后，使用一种分离器(如膜或离心机)把含有培养基固体物的细胞部分和含有2KGA的含水部分从培养液或细胞反应液中分离出来，并且由此得到的细胞部分能反复应用于下一次批量培养或微生物细胞反应中，优选的是使用新的培养基。在这种情况下，在把从培养液中分离的活微生物细胞接种到下一个培养基中(较好的是在反应完成之后)时，可以采用一种常用的方法使活细胞与培养其相接触。在本说明书中，“生产最终产物2KGA的发酵”也可简称为“2KGA发酵”，而“微生物细胞反应液”可包括“培养液”。“细胞重复使用性培养”也可称为“循环使用性培养”。本专利技术的方法适用于多种底物和微生物。本方法所用底物最好是糖或糖醇。底物实例包括L-山梨糖、D-葡萄糖和D-山梨糖醇。L-山梨糖是利用某些微生物的方法的最优选的底物。本专利技术所用微生物最好是细菌。更具体地说，可作为优选细菌的有假葡萄糖菌属、葡糖杆菌属、假单胞菌属、棒状杆菌属、醋杆菌属和欧文氏菌属的细菌。下文中将加以更具体地阐述本专利技术。本专利技术中所用的能产生2KGA的微生物的实例为假葡糖杆菌属、假单胞菌属、葡糖杆菌属、醋杆菌属或棒状杆菌属中的已知微生物，以及能结合2，5-双酮基-D-葡糖酸还原酶基因的欧文氏菌属微生物。除了这些微生物之外，凡能产生2K本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产２－酮基－Ｌ－古洛糖酸（下文简称２ＫＧＡ）的方法，该方法包括：（１）在含有能生成２ＫＧＡ底物的液体培养基中培养能由Ｌ－山梨糖生成２ＫＧＡ的微生物，（２）在回收培养液中的微生物的同时，回收所生成的２ＫＧＡ，（３）把所回收的 微生物接种到新的液体培养基中以用于以下的培养和（４）重复上述培养并至少再回收一次。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：山口高正，米户贤吉，田中义一，
申请(专利权)人：BASF公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]