除虫菌素糖苷配基合成酶基因制造技术

本发明专利技术提供了一种分离的ＤＮＡ，它含有编码除虫菌素糖苷配基合成酶功能域的ＤＮＡ序列，它是一种参与聚酮化合物生物合成的多功能酶蛋白，或其具有除虫菌素糖苷配基合成酶活性的变体，具体地讲，源于除虫链霉菌ＤＮＡ的一种序列上的功能性组件和亚组件，由所述ＤＮＡ或其变体所编码的多肽或其变体，一种含有所述ＤＮＡ或其变体的载体，一种用所述ＤＮＡ、其改进形式或所述载体转化过的宿主细胞，和一种生产除虫菌素的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码参与除虫菌素化合物(它是一种聚酮化合物)的生物合成的多功能酶的DNA；由所述DNA所编码的多肽；含有所述DNA的载体；用所述DNA或载体转化过的宿主细胞；和用于生产除虫菌素的方法。
技术介绍
聚酮化合物是含有多种天然物质的一类化合物，所述天然物质的结构和功能不同。已知聚酮化合物包括具有多种生物学活性的化合物，如抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗昆虫剂、抗肿瘤剂和免疫抑制剂、以及通过细菌、真菌和植物所生产的芳香化合物。上述各种聚酮化合物是通过相同的生物合成机制合成的，该机制与脂肪酸的生物合成十分相似。就是说，聚酮化合物是通过以下步骤生物合成的连续缩合包括乙酸和丙酸在内的低级脂肪酸，而随后的反应，如酮的还原、脱水和在延伸的酰基基团的β位置上的每一个羰基基团的烯酰还原，类似于脂肪酸合成。多种聚酮化合物的各种重复的合成过程是由一种大分子、多功能酶复合体催化的，它具有每一种催化活性所需要的特殊活性部位(功能域)。例如，聚酮化合物生物合成的一般反应方式披露于以下文献中遗传学年度综述24，37(1990)，和微生物学年度综述47，875(1993)。业已证实，编码聚酮化合物合成酶的DNA序列通常编码聚酮化合物主链合成的所有必需的活性。所述编码聚酮化合物合成酶的DNA序列由一些组件组成，即参与缩合步骤和缩合之后的修饰步骤的重复单元。每一种催化活性与每一个缩合步骤的特定羧酸成分的专一性有关，或与一个不同位点有关，该位点决定在特定缩合步骤之后所要获得的修饰功能。例如，国际申请号WO93/13663披露了编码红色糖多孢菌的聚酮化合物合成酶的基因的组成。该基因包括6个组件，每一个组件负责一个缩合步骤。就是说，酰基侧链延伸的正确序列和延伸链的修饰是由存在于每一个组件上的遗传信息决定的。就除虫菌素糖苷配基的生物合成机制而言，业已报导了与其他聚酮化合物相似，除虫菌素糖苷配基的合成单元是以低级脂肪酸，如乙酸和丙酸为其成分，而在红色糖多孢菌中，聚酮化合物合成酶由存在于产除虫菌素细菌中的组件组成。日本公开的未经过审查的专利申请号15391/91披露了一种与除虫菌素生物合成相关的DNA片段，但没有提供该DNA片段的核苷酸序列。该公开文献仅仅推测有聚酮化合物合成酶的存在，这种酶参与了除虫菌素糖苷配基的合成，以及部分组件的存在。因此，无法预测除虫菌素聚酮合成酶的完整结构。类似地，MacNeil等报导了部分组件的功能域结构。不过，他们没有披露作为除虫菌素聚酮化合物合成酶的证据的核苷酸序列。在培育能用于新工艺中的细菌菌株时，改变聚酮化合物合成酶可能是一种十分有用的育种技术，所述新工艺可用于生产能用作兽药和农药的新型除虫菌素，并可以生产更有效的除虫菌素衍生物。实现所述改变所需要的步骤包括测定编码聚酮化合物合成酶的基因的完整核苷酸序列，根据该序列准确地确定每一组件的功能域结构，并导入需要的突变。不过，如上文所述，在实施所述改进的育种时是非常困难的，因为还不了解除虫菌素糖苷配基的聚酮化合物合成酶基因，并且该基因的核苷酸序列也是未知的。本专利技术人研究了通过改进与各种方法的聚酮化合物合成相关的DNA生产不同于由野生型菌株所产生的成分的方法。为了采用本方法，首先，我们必须分离参与一种聚酮化合物生物合成的DNA分子。因此，本专利技术的一个目的是提供一种编码参与除虫菌素糖苷配基生物合成的多功能酶的DNA，以及用所述DNA生产除虫菌素糖苷配基、改变了的除虫菌素糖苷配基、除虫菌素、和改进了的除虫菌素的方法。
技术实现思路
为实现上述目的，专利技术人进行深入的研究。结果，本专利技术人成功地分离了编码参与除虫菌素糖苷配基生物合成的多功能酶的DNA。本专利技术就是基于这一结果而完成的。本专利技术涉及下面的(1)-(43)。(1)一种编码除虫菌素糖苷配基合成酶的DNA(以下又被称作除虫菌素糖苷配基合成酶基因)。在本专利技术的一种实施方案中，所述DNA源于一种野生型产除虫菌素菌株或其突变菌株，如属于链霉属的菌株，特别是除虫链霉菌。(2)一种含有选自下列一组的核苷酸序列的DNASEQ ID NO1的1-11916和11971-30688号核苷酸，和SEQ ID NO2的1-14643和14824-31419号核苷酸；或一种能在严格条件下与该DNA杂交，并且编码一种具有除虫菌素糖苷配基合成酶活性的多肽的DNA。上述术语“一种能在严格条件下与该DNA杂交的DNA”是指利用具有SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的DNA通过菌落杂交、噬菌斑杂交或Southern杂交获得的，例如，所述DNA可以通过以下方法鉴定在65℃下，在有0.7-1.0摩尔/升氯化钠存在的条件下，用在它上面固定了来自菌落或噬菌斑的DNA的滤膜进行杂交，接着在65℃下用0.1-2×SSC溶液(1×SSC溶液含有150mM/升氯化钠，15mM/升柠檬酸钠)洗涤。杂交可以按照在实验方案中所介绍的方法进行，如分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989(以下简称为分子克隆第2版)，当代分子生物学方法，John Wiley&Sons，1987-1997(以下简称为当代分子生物学方法)，DNA克隆1；核心技术，实践方法，第2版，牛津大学，1995。可以杂交的DNA的具体例子包括与选自下列一组的核苷酸序列至少具有80％，或更优选95％或更高同源性的DNASEQ ID NO1的1-11916号核苷酸和11971-30688号核苷酸，和SEQ IDNO2的1-14643号核苷酸和14824-31419号核苷酸。下面的术语“一种能在严格条件下与该DNA杂交的DNA”也可以按上文所述方式定义。(3)如上述(1)或(2)的DNA，其中，该DNA包括编码除虫菌素糖苷配基合成酶功能域的DNA。(4)如上述(3)的DNA，其中，该DNA编码选自下列一组的除虫菌素糖苷配基合成酶功能域一种编码具有酰基转移酶活性和酰基载体蛋白活性的多肽的DNA；一种编码具有β-酮脂酰-ACP合成酶活性、酰基转移酶活性、β-酮脂酰-ACP还原酶活性和酰基载体蛋白活性的多肽的DNA；一种编码具有β-酮脂酰-ACP合成酶活性、酰基转移酶活性、脱水酶活性、β-酮脂酰-ACP还原酶活性和酰基载体蛋白活性的多肽的DNA；一种编码具有β-酮脂酰-ACP合成酶活性、酰基转移酶活性、和酰基载体蛋白活性的多肽的DNA；和一种编码具有β-酮脂酰-ACP合成酶活性、酰基转移酶活性、脱水酶活性、β-酮脂酰-ACP还原酶活性、酰基载体蛋白活性和硫酯酶活性的多肽的DNA。(5)如上述(4)的DNA，其中，所述编码具有酰基转移酶活性和酰基载体蛋白活性的多肽的DNA是包括SEQ ID NO1的85-1353号核苷酸的核苷酸序列的DNA；或一种能在严格条件下与该DNA杂交，并且编码具有酰基转移酶活性和酰基载体蛋白活性的多肽的DNA。(6)如上述(4)的DNA，其中，所述编码具有β-酮脂酰-ACP合成酶活性、酰基转移酶活性、β-酮脂酰-ACP还原酶活性、和酰基载体蛋白活性的多肽的DNA是一种包括选自下列一组的核苷酸序列的DNASEQ ID NO1的1441-6180、15217-19938和20008-24690号核苷酸和SEQ ID NO2的100-4692和14935本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码除虫菌素糖苷配基合成酶的ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：大村智，池田治生，
申请(专利权)人：社团法人北里研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]