对磷脂酰肌醇聚糖‑3（GPC3）具有亲和力的人脂质运载蛋白2的突变蛋白制造技术

本发明专利技术涉及针对磷脂酰肌醇聚糖‑3(GPC3)的新型、特异性结合治疗性和/或诊断性蛋白，该蛋白优选为脂质运载蛋白的突变蛋白，更优选为脂质运载蛋白2(Lcn2或NGAL)的突变蛋白。本发明专利技术还涉及编码这种蛋白的核酸分子以及这种蛋白和核酸分子的产生方法和用途。因此，本发明专利技术还涉及包含这种脂质运载蛋白的药学的和/或诊断性组合物，包括这些蛋白的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)具有亲和力的人脂质运载蛋白2的突变蛋白
技术介绍
磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)是一种属于糖基-磷脂酰肌醇-锚式硫酸肝素蛋白聚糖的磷脂酰肌醇聚糖家族的癌胚抗原。磷脂酰肌醇聚糖的特征是与称为硫酸肝素糖胺聚糖的复合多糖链共价连接。磷脂酰肌醇聚糖参与在细胞-细胞外基质界面处的细胞信号传导(Sasisekharan等人，Nat.Rev.Cancer2：521-528(2002))。目前为止，已经识别了人磷脂酰肌醇聚糖家族的六种不同的成员。细胞膜结合的GPC3由通过一个或多个二硫键连接的两个亚基组成。GPC3在发育中的胎儿肝脏和胎盘中表达，并在正常成人组织中下调或沉默。GPC3基因中的突变和消耗是人中胎儿生长过度(Simpson-Golabi-Behmel)或辛普森畸形综合征(Simpsondysmorphiasyndrome)的原因。GPC3在各种癌症，特别是肝细胞癌(“HCC”)、黑色素瘤、WiIm'肿瘤和肝母细胞瘤中表达(Jakubovic和Jothy，Ex.MoI.Path.82：184-189(2007)；Nakatsura和Nishimura，Biodrugs19(2)：71-77(2005))。HCC是全球癌症相关死亡的第三大原因。每年，HCC造成约100万死亡(Nakatsura和Nishimura，Biodrugs19(2)：71-77(2005))。乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和导致肝硬化的慢性酗酒仍是HCC的最常见原因。在美国，HCC的发病率急剧增加，部分原因是丙型肝炎病毒的传播。主要通过肝移植或肿瘤切除术治疗HCC。患者的预后依赖于潜在的肝功能和诊断出肿瘤的阶段(Parikh和Hyman，AmJMed.120(3)：194-202(2007))。需要治疗HCC和其它表达GPC3的肿瘤的有效策略。因此，期望拥有用于靶向GPC3，优选地在肿瘤细胞上表达的GPC3的手段和方法。国际专利申请No.PCT/EP2011/070119公开了源自人脂质运载蛋白2(也称为人嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(hNGAL))的脂质运载蛋白突变蛋白，其能够结合GPC3。然而，本专利技术提供另外的GPC3结合蛋白，其具有伴随这些蛋白的先进特征。附图说明图1：示出了如在基于MSD的分析中测量的，选择的优化的GPC3特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNOs：7、9和10)在用人GPC3转染的SK-HEP-1细胞上的结合。优化的克隆以亚纳摩尔至低纳摩尔的EC50值结合GPC3阳性细胞，而未检测到阴性对照脂质运载蛋白(SEQIDNO：2)的显著结合。用小鼠或猕猴GPC3转染的SK-HEP-1细胞观察到了类似的结合，而脂质运载蛋白突变蛋白不结合对照细胞(SK-HEP-1：：载体)。具体实施方式本专利技术的一个实施方案涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够以通过约1nM或更低的KD量度的亲和力结合人GPC3。更优选地，该突变蛋白可具有通过约1nM或约0.2nM或更低的KD量度的亲和力。在另一个实施方案中，在细胞结合分析中，例如在基本上如实施例5所述的分析中，该突变蛋白能够优选地以约25nM、10nM或3nM或更低的EC50值竞争结合人GPC3。在另一个实施方案中，本专利技术涉及一种脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白在对应于hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和/或175的一个或多个位置处包含置换，优选地为本文所述的置换。在特别的实施方案中，本专利技术的突变蛋白在对应于成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和/或175的序列位置处包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或甚至更多(比如21、22、23、24、25或26)个置换。在进一步特别的实施方案中，根据本专利技术的脂质运载蛋白突变蛋白包含选自SEQIDNOs：5-16的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述突变蛋白与成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的序列具有至少70％的同一性。优选地，所述突变蛋白在成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和/175处包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或甚至更多(比如21、22、23、24、25或26)个突变的氨基酸残基。在一些另外的实施方案中，为了促进在真核细胞中的表达，在根据本专利技术的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列位置处移除成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的位置65处的天然N-糖基化位点Asn，例如，通过位置65处的从Asn至Asp的突变。此外，优选地，根据本专利技术的脂质运载蛋白突变蛋白上不存在N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)。在一些其它的实施方案中，例如，为了进一步优化稳定性，根据本专利技术的脂质运载蛋白突变蛋白在对应于成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的序列位置28的序列位置处不包含突变。在另一个实施方案中，本专利技术的突变蛋白与选自有机分子、酶标记、放射性标记、着色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、细胞生长抑制剂、毒素、金属络合物、金属和胶体金的化合物缀合。所述突变蛋白可在其N-末端和/或其C-末端与融合配偶体融合，该融合配偶体是蛋白、蛋白结构域或肽。在另一个实施方案中，所述突变蛋白与延长该突变蛋白血清半衰期的化合物缀合。更优选地，所述突变蛋白与选自聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白结合肽和白蛋白结合蛋白的化合物缀合。在另一个实施方案中，本专利技术的突变蛋白是GPC3的拮抗剂。在另一实施方案中，本专利技术涉及一种核酸分子，该核酸分子包含编码本专利技术的突变蛋白的核苷酸序列。在再另一个实施方案中，本专利技术涵盖一种宿主细胞，该宿主细胞含有所述核酸分子。本专利技术还包括一种治疗肿瘤，优选地治疗肝肿瘤或黑色素瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用包含本文所述的突变蛋白的药物组合物。一方面，本专利技术涉及针对GPC3或GPC3特异性的新型特异性结合蛋白。本专利技术的蛋白可用于治疗性和/或诊断性目的。本专利技术的蛋白尤其包含本文所述的hNGAL突变蛋白。如本文所用，由于结合特异性不是绝对的，而是一种相对性质，因此，若本专利技术的蛋白能够区分靶标和一个或多个参照靶标，则其“特异性地结合”这种靶标(本文中为GPC3)。可以例如根据蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-试验、FACS、IHC和肽扫描来测定“特异性结合”。同样地，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够以约1nM或更低的KD的亲和力结合磷脂酰肌醇聚糖‑3(GPC3)，其中，与成熟hNGAL(SEQ ID NO：1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白在序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和/或175处包含至少20个突变的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.18 EP 15167922.21.一种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够以约1nM或更低的KD的亲和力结合磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)，其中，与成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白在序列位置36、40、41、49、52、65、68、70、72、73、77、79、81、87、96、100、103、105、106、125、127、132、134、136和/或175处包含至少20个突变的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的突变蛋白，其中，与所述成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下突变的氨基酸残基中的至少一个：Leu36→Val或Arg.；Ala40→Leu、Val或Gly；Ile41→Leu、Arg、Met、Gly或Ala；Gln49→Pro或Leu；Tyr52→Arg或Trp；Asn65→Asp；Ser68→Val、Gly、Asn或Ala；Leu70→Arg、Ser、Ala或Val：Arg72→Asp、Trp、Ala或Gly；Lys73→Gly、Arg、Asn、Glu或Ser；Cys76→Val或Ile；Asp77→His、Met、Val、Leu、Thr或Lys；Trp79→Lys、Ser或Thr；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Arg、Asp、Gln或Pro；Tyr100→Gly、Glu、Pro或Gln；Leu103→Glu、Gln、Asn、Gly、Ser或Tyr；Ser105→Ala；Tyr106→Asn、Ser或Thr；Lys125→Glu；Ser127→Arg或Tyr；Tyr132→Trp或Ile；Lys134→Ala或Phe；Thr136→Ile；和Cys175→Ala。3.根据权利要求1或2中任一项所述的突变蛋白，其中，当通过基本上如实施例4所述的表面等离子体共振(SPR)分析测量时，所述突变蛋白以比SEQIDNO：3的突变蛋白更强的结合亲和力结合GPC3。4.根据权利要求1或2中任一项所述的突变蛋白，其中，当通过基本上如实施例5所述的基于用人、小鼠或猕猴GPC3转染的SK-HEP-1细胞的分析测量时，所述突变蛋白相比于SEQIDNO：4的突变蛋白显示改善的EC50值。5.根据权利要求1或2中任一项所述的突变蛋白，其中，当通过基本上如实施例6所述的基于荧光的热变性分析测量时，所述突变蛋白比SEQIDNO：3的突变蛋白更具生物物理稳定性。6.根据权利要求1或2中任一项所述的突变蛋白，其中，所述突变蛋白在对应于所述成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的序列位置28的序列位置处不包含突变。7.根据权利要求1或2中任一项所述的突变蛋白，其中，在所述突变蛋白的相应位置处移除在所述成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列的位置65处的天然N-糖基化位点Asn。8.根据权利要求1至7中任一项所述的突变蛋白，其中，与所述成熟hNGAL(SEQIDNO：1)的线性多肽序列相比，所述突变蛋白的氨基酸序列包含以下氨基酸置换组之一：(a)Leu36→Val；Ile41→Leu；Gln49→Leu；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Val；Leu70→Ser；Arg72→Trp；Lys73→Arg；Asp77→His；Trp79→Lys；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Asp；Tyr100→Gly；Leu103→Gln；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Arg；Tyr132→Trp；Lys134→Ala；(b)Leu36→Val；Ala40→Val；Ile41→Arg；Gln49→Pro；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Ser68→Gly；Leu70→Ser；Lys73→Gly；Asp77→His；Trp79→Lys；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Asp；Tyr100→Gly；Leu103→Glu；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Arg；Tyr132→Trp；Lys134→Phe；(c)Leu36→Val；Ala40→Gly；Ile41→Met；Gln49→Leu；Tyr52→Arg；Asn65→Asp；Leu70→Ala；Lys73→Asn；Asp77→His；Trp79→Lys；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Gly；Leu103→Glu；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Arg；Tyr132→Trp；Lys134→Phe；(d)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Trp；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Arg；Asp77→Leu；Trp79→Ser；Arg81→Gly；Cys87→Ser；Asn96→Gln；Tyr100→Glu；Leu103→Asn；Ser105→Ala；Tyr106→Asn；Lys125→Glu；Ser127→Tyr；Tyr132→Ile；Lys134→Phe；Thr136→Ile；(e)Leu36→Arg；Ala40→Val；Ile41→Gly；Gln49→Pro；Tyr52→Trp；Asn65→Asp；Ser68→Asn；Leu70→Arg；Arg72→Ala；Lys73→Arg；Asp77→Thr；Trp79→Ser；Arg8...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·欣纳，A·艾乐斯道夫尔，R·S·贝莱巴，M·阿洛伊，A·维登曼，G·马茨钦格，M·修尔斯迈耶，
申请(专利权)人：皮里斯制药有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE