用于治疗IL4介导疾病的重组IL4抗体制造技术

本发明专利技术提供了源自高度亲合的单克隆抗体的嵌合和人源化ＩＬ４单克隆抗体，含有该抗体的药物组合物及治疗方法。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请系1994年09月07日提交的，申请号为94193929.4，专利技术名称与本申请相同的申请的分案申请。后一申请是1993年10月14日递交的美国申请号No.08/136，783的部分接续申请，No.08/136,783又是1993年9月7日递交的美国申请号No.08/117,366的接续申请，两份申请在此均作为参考文献。白细胞介素4(IL4)是淋巴系统中的蛋白质介体。对来自特应性个体的淋巴细胞的研究表明，在对刺激产生的反应中存在着高于正常数目的T淋巴细胞，其具有分泌IL4的能力，且刺激之后分泌出较大量的IL4。人们已发现抗-IL4抗体能抑制IgE，但不能抑制IgG1或IgG2，及能抑制IL5分泌T细胞的产生。并且，最近的数据显示出IL4可能会影响组织中嗜曙红细胞的积累。参见如Tepper等Cell.62457(1990)；Tepper等，Cell，57503(1989)。本领域仍需求一种高度亲合性IL4拮抗剂，其通过减少IL5分泌细胞的繁殖和抑制嗜曙红细胞可能在组织中累积的贴壁机制，从而减少嗜曙红细胞的发炎，并且能用于治疗、预防和诊断特应性反应。相关方面，本专利技术提供了源自非人类中和单克隆抗体(MAb)的CDRs，该单克隆抗体与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M，并且本专利技术提供了编码该CDRs的核酸分子。在另一方面，本专利技术提供了人源化抗体，其具有至少一种且优选六种源自非人类中和单克隆抗体(MAb)的互补决定区，该单克隆抗体的特征在于与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M。在另一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗体，其含有人重链和轻链恒定区及源自非人类中和单克隆抗体(MAb)的重链和轻链可变区，该单克隆抗体的特征在于与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M。另一方面，本专利技术提供了一种药物组合物，其含有上述一种(或多种)融合蛋白或MAbs(如人源化，嵌合等等)及一种药物上可接受的载体。进一步地，本专利技术提供了一种通过给药于人有效量的本专利技术药物组合物对人类进行治疗和/或预防变应性疾病的方法。还有一方面，本专利技术提供了融合蛋白，MAbs(如人源化的，嵌合的等等)，其CDRs、Fab或F(ab)2或其类似物的重组生产的方法及用于此重组生产中的成份，其中所述类似物源自非人类中和单克隆抗体(MAb)，该单克隆抗体特征在于与人IL4的解离常数等于或小于2×10-10M。其中所述的这些成份包括分离出的编码相同蛋白的核酸序列，含有在选择性调节序列控制下的该核酸序列的重组质粒，此调节序列能指导其在宿主细胞中的表达，以及用该重组质粒转染的宿主细胞(优选哺乳动物的)。生产方法包括在一定条件下培养本专利技术的转染宿主细胞系以使抗体，优选人源化抗体在所述细胞中被表达，以及从中分离出被表达的产品。本专利技术的另一方面是诊断变应性和其它与人体中过量免疫球蛋白E产生相关的疾病的方法，其包括将生物液体样品与融合蛋白，MAbs(如人源化的嵌合抗体等)及本专利技术的Fabs接触，并分析所述融合蛋白，MAb或Fab与人白细胞介素4间的结合是否存在。在本专利技术另一相关方面是提供了一种筛选对人白细胞介素4具有高滴度的单克隆抗体的方法，筛选方法包括(a)制备以人白细胞介素4的单克隆抗体的分泌作用为特征的杂交瘤细胞系；(b)用醛偶联的人白细胞介素-4或生物素化的人白细胞介素-4筛选所述的杂交瘤细胞系。优选地，以生物素化的人白细胞介素-4筛选杂交瘤细胞系。本专利技术还提供了与IL4具有高度亲和性的中和MAb，其Fab片断或F(ab′)2片断，其通过以醛偶联的人白细胞介素-4或生物素化的人IL4筛选杂交瘤产品库而制得。在另一方面，本专利技术提供了对人白细胞介素-4具有特异性且具有以解离常数等于或小于约2×10-10M的结合亲和力的啮齿动物中和单克隆抗体。这类单抗的例子有鼠MAb，3B9和大鼠MAb，6A1和其它具有相同识别性质的MAbs(即以特异性地与人IL4结合于3B9或6A1的相同表位，解离常数等于或小于约2×10-10M)。本专利技术的另一方面是杂交瘤3426A11C1B9 。本专利技术的其它方面及优点均在下面优选实施方案中被进一步详细地进行了描述。图2表明了鼠3B9的重链可变区(氨基酸20-140)，和天然信号序列(氨基酸1-19)。下划线部分表示CDRs。图3表明了人/鼠3B9嵌合抗体的重链可变区(氨基酸21-141)及其信号序列(氨基酸1-19SEQ ID NOS5和6)。下划线部分表示源自3B9的CDRs。图4表明了人源化3B9抗体的重链可变区(氨基酸20-141)及信号序列(氨基酸1-19SEQ IDNOS5和6)。下划线部分表示源自3B9的CDRs。图5表明了人源化3B9抗体的轻链可变区(氨基酸21-131)及信号序列(氨基酸1-20SEQ IDNOS7和8)。下划线部分表示源自3B9的CDRs。图6A是用于下述实施例4的重链信号序列。图6B是用于下述实施例4的轻链信号序列。图7是在哺乳动物细胞中用来表达嵌合IL4重链的质粒pIL4chhc3-pcd的示图。该质粒含有β-内酰胺酶基因(BETA LAC)，SV-40的复制起点(SV40)，巨细胞病毒启动子序列(CMV)，信号序列，SEQ ID NOS9和10的嵌合可变重链，人重链恒定区，来自牛生长激素(BGH)的聚腺苷酸信号，β珠蛋白启动子(beta glopro)，二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，和背景pUC19中的另一BGH序列聚腺苷酸信号。图8是在哺乳动物细胞中用来表达SEQ ID NOS1和2的嵌合IL4轻链可变区质粒pIL4chlc-pcdn的示图。该质粒不同于图7所示的质粒，其含有嵌合轻链可变区而不是嵌合重链可变区，人轻链可变区和新霉素基因(Neo)及DHFR。图9是在哺乳动物细胞中用来表达SEQ ID NOS11和12的合成IL4重链可变区质粒pIL4hzhc-l-pcd的示图。该质粒不同于图7所示的质粒，其含有人源化重链可变区，而不是嵌合重链的可变区。附图说明图10是在哺乳动物细胞中用来表达SEQ ID NOS13和14的人源化IL4轻链可变区质粒pIL4hzlc-0-Pcn的示图。该质粒不同于图8所示的质粒，其含有人源化轻链可变区，而不是嵌合轻链的可变区，并且没有编码DHFR基因。本专利技术的详细说明本专利技术提供了各种抗体，抗体片断和融合蛋白，特别是人源化抗体，其特征在于具有人IL4结合特异性，中和活性及与人IL4的高度亲和性，正如鼠MAb 3B9或大鼠MAb 6A1所例示一样。这些产品可用于治疗和药物组合物中，以治疗IL-4介导的和IgE-介导的变应性反应。这些产品也可用于IL-4介导的症状的诊断中，通过在人体内测量循环的内源性IL4水平来诊断(如酶联免疫吸附分析(ELISA))。I.定义“融合蛋白”是指被融合分子编码的蛋白质，可通过在所选择宿主细胞中的表达而获得。这种融合蛋白为基因工程抗体，如嵌合或人源化抗体，或是缺少全部或部分免疫球蛋白恒定区的抗体片断，如Fv、Fab或F(ab)2等等。“融合分子”是指编码源于非人类免疫球蛋白的互补决定区(CDRs)的核酸序列，该CDRs被插在含有人可变构架序列的第一融合配体中。可选择地，该第一融合配体可操纵地与第二融合配体相连接。“第本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有与人白细胞介素－４（ＩＬ４）结合特异性的融合蛋白质，其包含特征为与人ＩＬ４的解离常数等于或小于２×１０↑［１０］Ｍ的源自非人类中和单克隆抗体的互补决定区（ＣＤＲｓ），和第一融合配体，其中所说的非人类中和单克隆抗体选自３Ｂ９和６Ａ ｌ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：SD霍尔姆斯，MS格罗斯，DR施尔韦斯特，
申请(专利权)人：史密丝克莱恩比彻姆公司，史密丝克莱恩比彻姆有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]