磷脂的碱交换方法技术

一种磷脂的碱交换方法，其特征在于：包括下述工序：　　　　在来自于放线菌的磷脂酶Ｄ存在下，使磷脂酰乙醇胺与选自醇类、含氮醇类、糖类、多元醇类及羟基环状碳氢化合物中的醇发生反应。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用磷脂酶D(以下简称为PLD)的酰基甘油磷脂的磷脂酰基转移反应方法。特别涉及以来自于大豆或卵黄等的天然磷脂酰乙醇胺或人工合成的磷脂酰乙醇胺为基质、将醇类作为磷脂酰基的受体、在PLD存在下使之进行反应的。
技术介绍
使用PLD的酰基甘油磷酯的磷脂酰基转移反应已广为人知。在该磷脂酰基转移反应中，主要使用磷脂酰胆碱(以下简称为PC)，不积极利用磷脂酰基乙醇胺(以下简称为PE)。其理由列举如下∶酰基甘油磷脂使PLD发生作用时，PE的磷脂酰基自身容易水解以及PC比PE容易发生磷脂酰基的转移反应(例如，参照非专利文献1)。例如专利文献1记载了使用PC的磷脂酰基的转移反应，没有利用PE。作为PC的磷脂酰基转移反应中使用的溶剂类来说，使用下面这样的种类及组成。例如，乙酸乙酯/2-丙醇/乙酸缓冲液＝45∶5∶25的透明的均一相(专利文献2)；二异丙醚/乙酸缓冲液＝40∶0.35等的逆胶态离子形成(专利文献3)；己烷-丙酮的混合液(99～1∶1)/水系缓冲液＝100∶0.1～200(专利文献4)等。但是，使用这些溶剂的现有技术中，没有积极地利用PE作为基质。另一方面，作为通常所使用的酰基甘油磷脂的大豆或卵黄的卵磷脂的主要成份是PC及PE(通常PC的含有率高一些)。现正制造使这些大豆或卵黄卵磷脂中的PC含有率提高的制剂。而且，其制造时，得到副产物PE为主要成份的卵磷脂，但根据上述的理由，在使用PLD的磷脂酰基转移反应的基质中，不再使用。特公平5-42197号公报 特公平5-38594号公报特公平7-16426号公报特开2001-186898号公报福田等、J.Biochem.、125卷，263-269页，1999年
技术实现思路
鉴于这样的实际状况，本专利技术的目的在于提供一种在PLD的存在下、使用PE作为基质、高效率地进行磷脂酰基转移反应的方法。本专利技术人等，为了解决上述课题，经过反复专心探讨研究的结果，发现通过调节反应时使用的溶剂的种类、组成、及添加的PLD的量，即使在PE作为基质的情况下，也得到和PC同等的磷脂酰基转移反应率，至此完成了本专利技术。即，本专利技术涉及一种，该方法含有下述工序在来自于放线菌的磷脂酶D存在下，使磷脂酰基乙醇胺与选自醇类、含氮醇类、糖类、多元醇类及羟基环状碳氢化合物中的醇发生反应。在优选的实施方式中，上述磷脂酶D来自于属于选自链霉菌属、小单孢菌属、诺卡氏菌属、拟诺卡氏菌属及马杜拉放线菌属中的放线菌的至少一种菌株。另外，在优选的实施方式中，上述反应是在庚烷∶丙酮∶水系溶剂的容量比率为60～90∶4～30∶2～20的溶剂中进行的。或者，上述反应是在己烷∶丙酮∶水系溶剂的容量比率为60～90∶4～30∶2～20的溶剂中进行的。在其它的优选实施方式中，每1g磷脂酰基乙醇胺中添加20～8000单位的上述磷脂酶D。本专利技术还涉及通过上述方法得到的酰基甘油磷脂。具体实施例方式在本专利技术的方法中作为基质使用的PE，可以来源于任何方面，例如可以来源于大豆、卵黄、菜种、鱼油、海洋藻类等。另外，可以使用合成的PE作为基质。在本专利技术的方法中，醇作为受体使用。受体醇选自醇类、含氮醇类、糖类、多元醇类及羟基环状碳氢化合物中。作为醇类列举如下，例如甲醇、乙醇、丙醇、抗坏血酸等。作为含氮醇类列举如下，例如丝氨酸等氨基酸、1-氨基-2-丙醇等。作为糖类列举如下，例如腺甙、鸟甙、肌甙、黄甙、脱氧腺甙、脱氧鸟甙等的核甙；葡萄糖、海藻糖、N-乙酰基-D-葡糖胺等。作为多元醇类列举如下，例如甘油醇、乙二醇、丙二醇等。作为羟基环状碳氢化合物列举如下，例如曲酸、熊果苷等。PE和受体醇的摩尔比，需要根据受体醇的种类进行适当选择。一般地，对于1摩尔PE，使用0.01～100倍摩尔的受体醇较合适。就本专利技术的方法中使用的放线菌来说，只要是能生成PLD的都可使用。特别优选使用属于链霉菌(Streptomyces)属、小单孢菌(Micromonospora)属、诺卡氏菌(Nocardia)属、拟诺卡氏菌(Nocardiopsis)属、马杜拉放线菌(Actinomadura)属等的微生物。更具体地列举如下，肉桂链霉菌(Streptomyces cinnamoneum IFO 12852)、青铜小单孢菌(Micromonospora chalcea ATCC 12452)、地中海诺卡氏菌(Nocardiamediterranei IFO 13142)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvilleiIFO 13908)、黎巴嫩马杜拉放线菌(Actinomadura libanotica IFO 14095)等。除此以外，如果是属于上述的菌属的放线菌，就可以使用众所周知的微生物及从自然界分离出来的微生物。另外，也可以在本专利技术的方法中使用使PLD的生产性提高的微生物的变异株及将从上述微生物分离出的PLD遗传因子导入至同种或异种的宿主从而提高PLD的生产性的菌株。PLD通常是需氧培养上述微生物而得到的。作为培养时用的培养基来说，可使用微生物培养中通常使用的培养基。作为碳源来说，例如使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、糊精、糖蜜、甘油等能同化的碳水化合物、烃类等。作为氮源来说，只要是能利用的氮化物，没有特别限制。例如使用玉米浸渍液、大豆粉、小麦谷蛋白、胨、肉精、酵母精、麦芽精、酪蛋白等。根据需要可使用其它的物质，例如磷酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类。培养温度是在菌生长且生成PLD的范围内适当采用。通常在15～40℃培养。培养时间根据条件的不同而不同，可以在PLD活性最大时结束培养，通常在1～6天左右。另外，PLD，既可以是在菌体外生成的，也可以是在菌体内生成的。例如，既可以是含有PLD的培养液，也可以是由培养液或培养菌体精制的酶。它们均可以在本专利技术的方法中使用。在本专利技术的方法中使用的来自于放线菌的PLD的使用量，相对于1g的PE，可在20～8000单位的范围内选择。另外，酶活性的1个单位是以95％卵黄制磷脂酰胆碱(和光纯药社制，代码169-12751)为基质、在37℃下、使基质浓度0.16％的0.2M乙酸缓冲溶液(pH4.0，含有10mM的CaCl2、1.3％的Triton X-100)进行反应时、1分钟游离的1μmol胆碱的酶量。在本专利技术的方法中，磷脂酰基转移反应中使用的反应溶剂，是水系溶剂和有机溶剂两者。作为有机溶剂，可列举如下n-庚烷、n-己烷、石油醚等的脂肪族烃；环戊烷、环己烷等的环状脂肪烃；二乙醚、四氢呋喃等的醚类；乙酸甲酯、乙酸乙酯等的酯类；四氯化碳、氯仿等的卤化烃类。所谓水系溶剂是指水及水性缓冲溶液。作为水来说，优选使用离子交换水、精制水或蒸馏水，也能使用自来水。作为水性缓冲溶液来说，优选使用例如pH4～6的乙酸缓冲溶液、pH7～8的磷酸缓冲溶液等。上述反应溶剂中的水系溶剂和有机溶剂的混合比，可以根据所使用的有机溶剂的种类进行适当选择。一般地，可以混合使用水系溶剂有机溶剂的容量比率在1∶0.65～1∶100的范围内的水系溶剂和有机溶剂。为了抑制作为副反应的PE的磷脂酰基的水解反应、并高效率地进行目的的磷脂酰基的转移反应，优选反应系中的水系溶剂的含量在10容量％以下进行。另外，有机溶剂的选择及混合比可任意选择。反本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：椎原美沙，刘晓丽，藤原洋子，
申请(专利权)人：长濑化成株式会社，
类型：发明
国别省市：