抗冻蛋白的制备制造技术

一种生产Ⅲ型抗冻蛋白（ＡＦＰ）的方法，该方法包含在蛋白糖基化缺陷的真菌宿主细胞中表达编码ＡＦＰ的核酸序列。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
抗冻蛋白(AFPs)是一种多肽，多种物种均能产生，尤其是那些较冷气候地区的原生物种，它们具有抑制水和含水物质在低于0℃的温度下结冰的能力。一般认为上述蛋白通过与冰晶相互作用而抑制冰晶的生长，但现在已经清楚地认识到，实际上存在多种不同种类的抗冻蛋白，它们可能具有不同的作用机制，并具有不同的作用效果。例如，AFPs除对冰/水体系的冷冻/融化行为导致热滞后之外，它还影响冷冻时所形成的冰晶的大小和形状，并抑制冰的重结晶。最近的研究表明，上述蛋白应当是曾被称作冰结构蛋白(ISPs)的已知蛋白(Clarke，C.J.，Buckley，S.L.，和Lindner，N.，Cryoletters.，23(2002)89-92)。AFPs所具有的这些特性意味着它们可能对各种冷冻产品的性质，如生产时的难易程度、在各种冷冻制剂储存期间的品质和稳定性，带来深刻的影响，最近几年，人们特别关注这些蛋白的商业用途，特别是在食品工业中。例如，在冷冻糖果时，需要控制冰晶的大小以提高产品品质。同样，在配方中加入AFPs也能够改善产品的储存特性。关于AFPs在食品工业中的应用，Griffith和Vanya Ewart在文献Biotechnology Advances，13卷，375-402页(1995)中曾做过综述。为了适用于上述目的，AFP需要对与之混合的冷冻物质具有预期的作用效果，而且需要能够容易地进行工业化生产。尤其是后者是问题的关键，因为许多已经鉴定出来的AFPs种类不太容易商品化生产或制备。已经发现一些种类的AFPs非常容易变性，这严重制约了所使用的分离方法。考虑到这些难题，人们非常关注通过在更加有利于表达的宿主中表达编码上述蛋白的克隆基因的方法来制备AFPs，表达宿主如微生物或易于培植和加工处理的植物。然而，对于多种AFPs来说，这也是一个问题，因为通常情况下蛋白在表达宿主中的产率很低，而且有时缺乏活性。已经鉴定出的AFPs中，最具有潜力的是来自海洋大头鱼(OceanPout)的III型AFP，命名为HPLC-12。发现该蛋白在控制冰晶的形状和大小方面具有卓越的能力。例如，在重结晶试验中，该蛋白的表现优于已知的I类AFPs。III类HPLC-12的一个更加有利的特性是，尽管它在大肠杆菌(E.coli)中生产量很低，但是它能够在转化的酵母中通过表达编码蛋白序列的克隆基因而生产出大量的蛋白，从而提供了一种潜在的比从天然鱼类提取更加方便、更加经济有效的蛋白来源，以更加适应工业化生产。蛋白糖基化涉及到大量的酶，其中一种或多种酶缺乏可以会改变糖基化模式。负责将第一个糖残基转移到蛋白上的酶如果丧失活性，将会抑制任一糖基化过程。因此提示，使用这样的蛋白甘露糖基转移酶(pmt)-缺陷型的突变酵母株，来克服异源表达蛋白的不正常糖基化所带来的问题(WO94/04687)。然而，实际的情况却是复杂的，因为具有上述功能的酶不仅仅有一种，而是有多种，而且它们具有不同的蛋白特异性。例如，对于O-甘露糖基化蛋白，Strahl-Bolsinger等(Biochimica et Biophysica Acta 1426(1999)297-307)指出，在所研究的十种O-糖基化的蛋白中，其中六种在酵母中被酶Pmt1和Pmt2糖基化，另外四种在丧失Pmt4酶活性的菌株中表现出O-甘露糖基化降低或缺乏。在另外一种丧失Pmt3酶活性的突变菌株中，在所分析的蛋白中没有观察到糖基化降低的现象，然而该突变在带有Pmt1Pmt2双突变遗传背景的菌株中却能够导致壳多糖酶O-甘露糖基化的降低。已经证实，甘露糖基化特异性与蛋白底物的序列或结构特征之间没有相关性，因此不可能预测何种特定转移酶可能负责启动何种特定蛋白的糖基化，不管蛋白是糖基化物种的天然蛋白，还是在物种中异源表达的外源蛋白。专利技术概述本专利技术人发现，在酵母中生产的III型HPLC-12具有特殊的活性，在重结晶抑制试验中检测到，HPLC-12所形成的冰晶要小于分离自海洋大头鱼类血液的蛋白。专利技术人能够证明这是酵母对蛋白的O-糖基化所带来的结果，这种糖基化过程在鱼类生产的天然蛋白中不会发生。令人惊奇的是，只有未被糖基化的蛋白种类才具有上述活性。这是意料之外的，因为本申请有关AFPs的试验证据没有表明糖基化和功能之间具有清楚一致的模式事实上，一些AFPs在自然情况下糖基化程度很高。例如，DeVries等(Science 172(1971)1152)报道在北方鳕鱼和南极notothenioids中发现的一种AFP，当去掉二糖侧链后，其活性即会丧失。另外一种情况表明自然发生的糖基化对AFP活性并不重要。例如，Worrall等(Science 282(1998)115-117)发现胡萝卜中的一种自然糖基化的AFP，在生产时虽然没有表面多糖，但其重结晶抑制活性却不受影响。本专利技术人异源表达黑麦草AFP的试验同样表明，AFP的活性不依赖于糖基化，即使蛋白在天然情况下是糖基化的。因此，在有关AFPs的研究文献，没有明确显示糖基化和活性之间具有必然的联系。进一步，基于上述意料之外的发现，本专利技术人提供了一种基本上抑制III型AFP发生不正常糖基化的方法，并由此提供了一种生产III型AFPs，如III型HPLC-12蛋白的方法，该方法以酵母为宿主，不仅方便、成本低、效率高，而且与获取天然蛋白相比，显著提高了产物产量。专利技术人发现使用该方法，不仅能提高重组蛋白的产量，而且还能提高重组蛋白的特异活性，也就是说可以从宿主细胞中收获更多的蛋白，并且在上述蛋白中，具有活性的蛋白的比例更高。因此，本专利技术的第一个方面是提供一种生产III型抗冻蛋白(AFP)的方法，该方法包含在蛋白糖基化缺陷型的真菌宿主细胞中表达编码AFP的核酸序列。在一个优选实施方式中，真菌宿主细胞是蛋白糖基化缺陷型，其是由一个或多个编码蛋白糖基化相关酶的基因发生突变引起的。优选地，真菌细胞是O-糖基化缺陷型，更优选地是缺乏一种或多种蛋白甘露糖基转移酶活性的缺陷型。在一个优选实施方式中，真菌宿主细胞是酵母，如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选pmt1缺陷型和/或pmt2缺陷型的突变酵母菌株。在另一相关方面，本专利技术还提供了一种通过降低蛋白的糖基化程度来提高III型抗冻蛋白(AFP)或其功能等同物抗冻活性的方法，其中所述蛋白是通过在异源真菌物种中表达编码蛋白的基因/核酸序列来制备的。优选使用冰重结晶抑制试验来测定特定AFP的活性。在一个优选实施方式中，降低蛋白糖基化程度是通过如下方法获得的，方法如下筛选缺乏一种或多种蛋白糖基化相关酶活性，优选缺乏一种或多种蛋白甘露糖基转移酶活性的表达物种菌株。典型的，合适的糖基化缺陷型菌株是通过当编码所述蛋白的基因在所述菌株中表达时，对生产出的III型AFP蛋白进行分析而筛选的。优选地，对III型AFP蛋白的活性或功能进行分析，更优选地，对蛋白的冰重结晶抑制活性进行分析。在第二个方面，本专利技术提供了一种包含重组III型抗冻蛋白(AFP)的组合物，其中大约50％-99％的AFP是未被糖基化的。优选地，III型AFP是III型HPLC-12。在一个优选实施方式中，该组合物是可获得的，更加优选通过本专利技术第一方面的方法来获得。在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·查普曼，T·范德拉亚尔，N·M·林德纳，C·维斯塞，
申请(专利权)人：荷兰联合利华有限公司，
类型：发明
国别省市：