抗冻蛋白、DNA及其表达体系制造技术

在冷诱导和冷驯化作用下，冬裸麦产生一系列的抗冻蛋白，这些蛋白质类似于与病原体相关的蛋白质。在这些蛋白质中，有两种类几丁质酶蛋白，它们被利用分子生物技术进行复制，并且采用细菌和酵母（Ｐｉｃｈｉａ）体系以及Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ来表达。这种蛋白质重组体显示出几丁质酶活性和抗冻活性。本发明专利技术包括类似几丁质酶的抗冻蛋白的ＤＮＡ和蛋白质序列，任何这种序列的变体，这些蛋白质的表达法，以及它们在农业、食品和医药领域上的应用。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在本专利申请中，完整地引用和采用了下列专利英国专利临时申请号9112774.69(1991年6月13日提出申请)，美国申请号08/060,425(1993年5月11日提出申请)，美国申请号08/419,061(1995年4月10日提出申请)，美国申请号08/485,647(1995年6月10日提出申请)，加拿大专利申请号2,110,510(1992年6月12日提出申请)，欧洲专利申请号92911435.3(1992年6月12日提出申请)，PCT申请号PCT/CA92/00255(1992年6月12日提出申请)，以及美国专利申请号08/903,872。本专利申请要求基于美国专利申请号08/903,872的优先权。本专利技术的范围本专利技术涉及植物抗冻蛋白、肽和多肽(下文又称为“AFP”)，它们凝固在冰的晶体上，阻止冰重结晶，并且保护在低温状况下的脂质体、细胞膜和蛋白质、细胞和有机体。本专利技术还涉及以几丁质酶和抗冻活性给蛋白质编码的DNA序列，以及在细菌、酵母、植物和动物中的DNA序列的表达方法，以便生产有抗冻活性的几丁质酶。本专利技术的背景对于农作物的生产，低温是一种主要的环境限制因素。例如，暮春的霜冻延误了种子的萌芽，初秋的霜冻降低了农作物收成的质量和产量，冬季的低温降低了越冬作物(例如谷物和果树)的存活机会。然而，有些植物能够长期，耐受住低于冰点的温度。通过认出和分离在这些植物中的有助于形成耐霜冻能力的蛋白质，以及相应的基因，可以把对霜冻敏感的农作物改造成耐霜冻的农作物，并延长作物的生产期，。GUY等人(I-5.1)分析对冷驯化的菠菜组织中的蛋白质总含量与在温暖地区生长的植物组织中的蛋白质总含量进行了比较分析，发现蛋白质与植物对寒冷的耐受能力有关。在冷驯化的叶的提取物中发现的，分子量为110，82，66，55和13 KD的蛋白质，没有出现在温暖地区生长的叶的提取物中。GUY等人(I-5.2)还检查了冷驯化的菠菜叶中的蛋白质总含量，并且观察了高分子量的蛋白质(110，90和79KD)的积聚。对于GUY等人(I-5.1)，在植物内部，这些蛋白质的位置和功能仍然是未知的。然而，我们已经知道，许多生物有机体通过避开冰的形成而能够在低于冰点的温度条件下存活下来。这个策略要求合成抗冻蛋白(AFP)，这种蛋白质又称为“热滞后蛋白质”(THP)。各种AFP冻结在冰晶体的表面，防止冰晶的进一步生成。各种AFP的存在是由下列研究确定的1)在冰晶形成的过程中，考察冰晶的形状(III-19、III-35、III-22)，2)测量热滞后性，这种滞后性是溶液中的冰晶熔化温度和冻结温度的差值(III-19)，以及3)测量对冰晶的重结晶的抑制能力。在鱼中认出出四种不同的AFP类型(II-4)，并且在昆虫中认出出一些不同的THP(III-12)。这些先前的发现提示了，这种适应机制已经在不同的有机体中独立的形成，而且这种机制是在防止在有机体内部生成任何结冰方面起着作用的。人们通常认为，各种AFP不存在于植物当中，因为能在低于冰点的温度条件下长期，存活下来的大多数植物在它们的组织中实际上有冰形成，通常是在胞间空隙中，以及在木质部导管中。KURKELA和FRANCK(I-9.1)报道过，一种在低温条件下显示的植物基因给一种蛋白质编码，类似于DAVUS和GEW所报道过的在氨基酸中给比目鱼的各种抗冻蛋白编码的情形(II-4)。KURKELA和FRANCK(I-9.1)未能有足够数量的编码蛋白质来确定是否呈现抗冻活性。CUTLER等人(I-1.1)CUTLER等人(I-1.1)指出，被注入了比目鱼抗冻蛋白的植物组织显示出其抗冻活性有轻微的提高。GEORGES等人(I-3.1)使用比目鱼抗冻蛋白的一种合成基因来改造谷物的原生质体，试图改善植物的抗冻活性。结果生成了一种蛋白质，但它未能有效地分泌，而且未能检测出抗冻活性。尽管从鱼类和昆虫中分离出来的抗冻蛋白已经被用于开发适用于储存在低温和低冰点的温度条件下的食品和生物物质的新的添加剂，但这些蛋白质仍然未有进入市场，因为它们被消费者认为是不合适的。例如，把一种鱼抗冻蛋白添加到冰琪琳中被认为是不可接受的，而把一种植物抗冻蛋白添加到冰琪琳中则被认为是可以接受的。从植物中分离出来的AF可望能比那些已经被定性为来自动物的抗冻蛋白在市场中有更广泛的应用。附图的简要说明本专利技术的首选实施方案将结合附图来加说明。这些附图包括I.植物的寒冷耐受能力附图说明图1描述了取自生长在不同温度条件下的冬裸麦叶的细胞间蛋白质的浓度。图2描述了分离自生长在不同温度条件下的冬裸麦叶的胞外蛋白质的多肽的“SDS-PAGE”。第一道分子量标记；第二道分离自生长在20/16摄氏度(昼/夜)(白天占16小时)的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第三道分离自生长在5/2摄氏度(昼/夜)(白天占16小时)的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第四道分离自生长在5/2摄氏度(昼/夜)(白天占8小时)的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽。图3描述了分离自生长在白天占8个小时的，在不同生长阶段的冷驯化冬裸麦叶的胞外蛋白质的多肽的“SDS-PAGE”。第一道分子量标记；第二道分离自生长在20/16摄氏度(昼/夜)(白天占16小时)温度条件下生长7天的裸麦作物的胞外多肽；第三道分离自首先生长在20/16摄氏度的温度条件下生长7天，然后移植到5/2摄氏度(昼/夜)，白天占8个小时的光照体制下再生长28天的裸麦作物的胞外多肽；第四道分离自移植到5/2摄氏度的温度条件下生长43天的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第五道分离自移植到5/2摄氏度的温度条件下生长50天的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第六道分离自移植到5/2摄氏度的温度条件下生长71天的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽；第七道分离自移植到5/2摄氏度的温度条件下生长95天的温度条件下的裸麦作物的胞外多肽。图4描述了分离自驯化冬裸麦叶的胞外蛋白质的多肽的“SDS-PAGE”。第一道分子量标记；第二道分离自首先生长在20/16摄氏度的温度条件下生长7天，然后移植到5/2摄氏度(昼/夜)，白天占8个小时的光照体制下再生长42天的裸麦作物的胞外多肽；第三、四和五道分别是分离自首先经过第二道所描述的生长过程，然后再移植到20/16摄氏度，白天所占的时间为16个小时的光照体制下分别再生长4天、6天和8天的裸麦作物的胞外多肽；图5描述了分离自生长在各种不同温度条件下的裸麦叶的，经过高度精密过滤的胞外提取物的冰晶形成能力。图6说明了在冷驯化的冬裸麦叶的胞外提取物中的抗冻活性。抗冻活性是通过利用一台毫微米渗压计(生产厂家美国纽约州哈特福特市CLIFTON技术物理公司，II-5)观察冰晶的形态来测定的。在C、D、E和F中的冰晶取向A轴线表示沿着基本平面生长，而C轴线则表示垂直于基本平面生长。图7说明了利用柱型色层分离法来分离自冷驯化的裸麦叶的胞外提取物的组分。图8说明了分离自冷驯化冬裸麦的叶的部分提纯和浓缩的抗冻蛋白的冰晶形态。A如图6所描述的晶体的取向。B、C和D在温度下降的过程中，冰晶的生长顺序。B不完全的双锥形；C双锥形；D针状晶体。图9与在图8中所示的每个280毫微米峰值的柱上分级相关的多肽“SDS-PAGE”。图10描本文档来自技高网...

【技术保护点】
来自单子叶植物的分离的核酸分子，这种分子编码一种抗冻蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔伊休，熊非，芭芭拉莫法特，玛丽莲格里菲思，
申请(专利权)人：埃斯生物工程公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]