一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽制造技术

本发明专利技术提供一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，制备方法具体为：以鮸鱼鱼肉为原料，通过鱼肉脱脂、复合酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、大孔树脂脱盐、阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到降血脂寡肽Val‑Ile‑Ala‑Pro‑Trp（VIAPW），ESI‑MS测定分子量为584.72Da。VIAPW既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，激活LXRα和LXRβ，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性。VIAPW具有安全无毒副作用、降血脂活性强等优点，可作为降血脂药品和保健食品进行开发。

Hypolipidemic oligopeptide a Miichthys miiuy fish

The present invention provides a hypolipidemic oligopeptide Miichthys miiuy fish, specific preparation methods for Miichthys miiuy fish as raw material, through fish degreasing, enzymolysis to enzymolysis liquid liquid by ultrafiltration, macroporous resin desalting, anion exchange resin chromatography, gel column chromatography and reversed-phase high performance liquid chromatography purified lipid peptide Val Ile Ala Pro Trp enzyme (VIAPW), ESI MS determination of molecular weight of 584.72Da. VIAPW can not only reduce the lipid gene, but also promote the fatty acid beta oxidation, reduce the production of lipids, activate LXR alpha and LXR beta, and have a better lipid-lowering activity than lipid producing level. VIAPW has the advantages of non toxic side effect, high blood lipid reducing activity and so on. It can be used as a blood lipid drug and health food.

【技术实现步骤摘要】
一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽
本专利技术涉及一种降血脂寡肽，具体涉及一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽。
技术介绍
血脂是血浆中甘油三酯、胆固醇等中性脂肪和糖脂与类固醇等类脂的总称。高脂血症属体内血脂代谢异常所致，因血脂过高诱发的动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等心脑血管疾病已严重威胁人类健康。随着现代人们生活水平的不断提高和生活方式的改变，由于不良饮食结构及不健康的生活习惯致使高脂血症患者与日俱增，并且正朝着年轻化的趋势发展。因此，降血脂功效成分筛选和降血脂药物开发的相关研究备受学术界关注。寡肽（bioactivepeptides）是3至9个氨基酸组合的肽类的总称。人体很多活性物质都是以肽的形式存在的。肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。但现代人面临着环境恶化、工作压力和现代饮食结构的隐患，造成人体生理机能的紊乱，人体自身合成肽的能力大大减弱，必须通过体外合成的活性肽补充原肽物质以养自身鮸鱼（Miichthysmiiuy）分布于北太平洋西部，包括中国的渤海、黄海及东海、朝鲜和日本南部。中国生产鮸鱼，尤以东海的舟山群岛产量最大，是我国经济价值较高的海产经济鱼类之一。鮸鱼肉质鲜美，含有丰富的维生素及钙、磷、铁等微量元素，是传统的滋补食材，具有养血、补肾、润肺健脾和消炎作用。但目前以鮸鱼鱼肉为原料，利用酶解工艺制备降血脂肽未见报道。因此，申请人以鮸鱼鱼肉为原料，利用酶解技术制备一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有降血脂作用的鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性，且安全无毒副作用，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。本专利技术为解决上述技术问题所采取的方案为：一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，降血脂寡肽为五肽化合物，降血脂寡肽的氨基酸序列为Val-Ile-Ala-Pro-Trp（VIAPW），降血脂寡肽的ESI-MS测定分子量为584.72Da。作为优选，一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其制备方法具体包括下述步骤：1）鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:4～6mL加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂20～26h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉，该步骤下鱼肉中脂肪脱除率高，不仅可除去非胶原蛋白的杂蛋白，且胶原蛋白的流失量小，对鱼肉中其他成分的性能无影响；2）鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:4～7mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入鱼肉重量1.0～1.5%木瓜蛋白酶，于45～55℃酶解3～5h，于90～100℃进行10～15min灭酶；酶液降温至50～60℃时，调节pH值至8.5～10.0，加入鱼肉重量1.0～2.0%碱性蛋白酶，反应3～5h，于90～100℃进行10～15min灭酶，冷却至常温，在11000～15000rmp下离心17～24min，收集上清液，即鮸鱼鱼肉酶解液，经过两次加酶酶解，鱼肉中蛋白质的转化率高，活性多肽的提取彻底，且操作条件控制合理，所得的活性多肽的品质高；3）鮸鱼鱼肉降血脂寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kDa、3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kDa组分，得到超滤酶解液。将超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍体积D101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鮸鱼鱼肉降血脂寡肽，该步骤纯化效果好，所得的降血脂寡肽具有较好的降酯活性，且安全无毒副作用，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。作为优选，步骤1中的鮸鱼为Miichthysmiiuy。作为优选，步骤3的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：离子交换树脂层析操作为：将步骤3中的多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为45~50mg/mL的溶液，加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用蒸馏水、0.1、0.5和1mol/L的NaCl溶液洗脱，收集0.1mol/L的NaCl洗脱组分，即为离子交换层析酶解物，该方法分离净化效果好，操作简单，条件控制的自由度高，同样适用于工业化生产；凝胶柱层析操作为：将离子交换树脂层析所得的离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为15~20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度制作凝胶层析色谱图，收集峰2，即为凝胶层析酶解物，该方法根据在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便、不影响目标组分化学性质；RP-HPLC纯化操作为：将凝胶柱层析所得的凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据制备多肽的降血脂活性得1个高降血脂活性多肽Val-Ile-Ala-Pro-Trp（VIAPW），该方法灵敏度高、分离效果好，能快速分离纯化目标产物。再优选，RP-HPLC纯化条件为：进样量为10~15μL；色谱柱为KromasilC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为40%乙腈；洗脱速度为0.8~1.0mL/min；紫外检测波长280nm。上述技术方案制备所得的鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽Val-Ile-Ala-Pro-Trp（VIAPW）能减少OA（油酸）诱导的HepG2细胞内脂质堆积；在1-10μM浓度下对总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）呈剂量依赖性分解作用；能降低成脂因子PPAPα、SREBP-1c、SREBP-2和FAS的表达水平，增强ACOX-1的表达水平；Westernblot试验显示VIAPW能抑制成脂重要因子SREBP-1c的蛋白表达水平，但不能抑制脂质合成相关基因ACC的表达；荧光素酶试验证明VIAPW既能激活LXRα的表达又能激活LXRβ的表达。因此，VIAPW既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，激活LXRα和LXRβ，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性。VIAPW具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可用于药品、保健食品和食品的用途，作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1）本专利技术的降血脂寡肽能减少OA（油酸）诱导的HepG2细胞内脂质堆积；2）本专利技术的降血脂寡肽既能下调成脂基因，又能促进脂肪酸β氧化，减少脂质的生成，激活LXRα和LXRβ，降脂质水平大于脂质生成能力，具有较好的降脂活性；3）本专利技术以鮸鱼鱼肉为原料，利用酶解技术制备一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，制备过程易控制，且降血脂寡肽的得率高，纯化后所得的降血脂寡肽纯度高、活性强；4）本专利技术的降血脂寡肽具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可作为药品、保健食品和食品的安全添加剂。附图说明图1为本专利技术DEAE-52阴离子交换树脂层析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其特征在于：所述的降血脂寡肽为五肽化合物，所述的降血脂寡肽的氨基酸序列为Val‑Ile‑Ala‑Pro‑Trp（VIAPW），所述的降血脂寡肽的ESI‑MS测定分子量为584.72Da。

【技术特征摘要】
1.一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其特征在于：所述的降血脂寡肽为五肽化合物，所述的降血脂寡肽的氨基酸序列为Val-Ile-Ala-Pro-Trp（VIAPW），所述的降血脂寡肽的ESI-MS测定分子量为584.72Da。2.根据权利要求1所述的一种鮸鱼鱼肉的降血脂寡肽，其特征在于：所述的降血脂寡肽的制备方法，具体包括下述步骤：1）鮸鱼鱼肉预处理：鮸鱼去鱼皮和鱼骨，鱼肉匀浆至糊状后，按料液比1g:4～6mL加入乙酸乙酯溶液，搅拌脱脂20～26h，过滤，干燥，得脱脂鮸鱼鱼肉；2）鮸鱼鱼肉的酶解：取脱脂鮸鱼鱼肉，按料液比1g:4～7mL加入蒸馏水，调节pH值至6.5～7.5，加入鱼肉重量1.0～1.5%木瓜蛋白酶，于45～55℃酶解3～5h，于90～100℃进行10～15min灭酶；酶液降温至50～60℃时，调节pH值至8.5～10.0，加入鱼肉重量1.0～2.0%碱性蛋白酶，反应3～5h，于90～100℃进行10～15min灭酶，冷却至常温，在11000～15000rmp下离心17～24min，收集上清液，即鮸鱼鱼肉酶解液；3）鮸鱼鱼肉降血脂寡肽的制备：将鮸鱼鱼肉酶解液经截留分子量为1kDa、3kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集截留分子量小于1kDa组分，得到超滤酶解液，将超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍体积D101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的60%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯...

【专利技术属性】
技术研发人员：王斌，潘欣，陶静，赵玉勤，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33