羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠。上述羊源的低分子肝素都有着共同的种源特征，在化学结构上，其主要二糖ΔUA2S‑GlcNS6S（ΔⅠS）含量在66%‑74%之间。羊低分子肝素与猪来源的低分子肝素，理化性质相似，生物学活性相近，拓展了低分子肝素类药物的来源。本发明专利技术介绍的羊低分子肝素制备方法，简单易行，工艺稳定，所得产品经过精制，可完全可符合各药典对现行低分子肝素的要求。羊低分子肝素还具有猪来源低分子肝素所不具有的清真性，在广大穆斯林人群、国家和地区，有着巨大的市场，可应用于抗凝、抗栓、抗炎、抗癌及清真药物。

Low molecular weight heparin derived from sheep and its preparation methods and Applications

【技术实现步骤摘要】
羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用
本专利技术涉及羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，其具有清真性，属于医药生物

技术介绍
低分子肝素(LowMolecularWeightHeparin，LWMH)，是目前临床上应用最广泛最重要的抗凝抗栓药物，一些低分子肝素还被广泛应用于抗炎和抗癌等临床治疗。低分子肝素经天然大分子肝素解聚制备，目前医用低分子肝素的来源，几乎均是猪肠粘膜肝素。不同动物或器官来源的肝素，化学结构上存在着一定的差异。肝素的分子结构均由氨基葡萄糖和两种糖醛酸(90％艾杜糖醛酸、10％葡萄糖醛酸)中的一种组成二糖重复单元，可以用一个四糖单元表示，如下中的a和b，而c则显示与抗凝血酶结合的五糖结构，是维持抗凝活性所必需的核心结构。备注：a有序“规则区”结构规整的三硫酸化二糖重复单元——ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)，在分子链中占主要；b无序“不规则区”硫酸化程度低，结构变化多样，在分子链中出现的频率较小；c与抗凝血酶结合的五糖结构，粗体表示的是维持抗凝活性所必需的，如除去则抗凝活性下降95％，斜体表示的也很重要，脱去后抗凝活性将下降25-50％。本专利技术人在之前的专利申请(申请公布号：CN105131153A)中，除了公布一种抗凝抗栓的羊依诺肝素钠外，还详细描述了羊肝素和猪肝素等在分子结构、二糖组成、理化性质和生物学活性等方面的异同。羊肝素中，主要二糖ΔⅠS的含量在66％-74％之间，次要二糖ΔUA-GlcNS6S(ΔⅡS)和ΔUA2S-GlcNS(ΔⅢS)的含量分别是8％-10％和4％-6％，而ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS在猪肠粘膜肝素中则分别是58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％，羊肝素和猪肝素的糖链显著不同，在理化性质和生物学活性上也呈现出差异。目前市场和临床上，没有羊来源肝素制备的低分子肝素。羊肝素和猪肝素明显不同，由其制备出的羊低分子肝素也将于猪肝素不同。另外，清真，是穆斯林在中国流行的专用名称，穆斯林教义对食品和药品等有着明确的要求，哺乳动物中只允许食用牛羊等反刍动物产品，禁食猪和狗等不反刍动物产品。全球穆斯林人口2013年突破16亿，占全球69亿人口的23％。在一些由穆斯林人口占多数的国家，如印度尼西亚、巴基斯坦、伊朗等等，符合穆斯林教义的清真药品有着无可比拟的优势。清真世界广泛缺乏清真药物，猪来源的肝素类药物不具有清真性，而羊源肝素则具有清真性，因此，开发清真的羊低分子肝素，有着极为重要的经济和社会价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供几种羊来源的低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，包括它们的制备方法及在抗凝抗栓抗癌和清真药物中的应用。本专利技术的目的，将通过以下技术方案得以实现：几种羊低分子肝素——羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，是以羊肝素制备得到的。上述羊低分子肝素制备所用的原料——羊肝素，其制备和预处理包括如下步骤：采用市售粗品羊肝素钠，提纯采取本行业所熟知的工艺，即以水溶解后保温盐解碱解，再加蛋白酶水解，水解液调pH后以阴离子交换树脂吸附并洗脱，以醇沉沉淀回收；回收后的羊肝素，采用质量浓度为1％-3％的氯化钠水溶液溶解至质量浓度5％-10％，优选以终体积浓度为0.1％-5％双氧水进行脱色0.5小时以上，反应液精过滤后优选以乙醇或其他有机溶剂沉淀回收，所用乙醇体积优选为反应液的1-3倍。优选地，所述经预处理得到的羊肝素，抗凝活性全绵羊血浆法折干后不少于150单位每毫克；且3.3％质量浓度的水溶液澄清且色度不深于5号标准色；所述色度不达标的羊肝素，可再进行一次或多次脱色处理，直至色度合格。优选地，所述羊肝素与猪肝素的差异，主要体现在分子量分布、二糖组成、活性对比和核磁图谱显示的结构差异上。优选地，所述羊肝素与猪肝素在分子量分布与分子量，猪肝素在15000Da-19000Da之间，而羊肝素则在13000Da-17000Da之间，分子量要小一些；优选地，所述羊肝素与猪肝素的二糖组成与差异，参照USP分析方法，猪肝素中的主要的二糖单元(ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS)分别在58％-66％、9.5％-11.5％和5.8％-7.8％之间，而羊肝素则在66％-74％、8％-10％和4％-6％之间，有显著的差异；而与抗-Ⅹa和抗-Ⅱa活性至关重要的核心五糖中3-位硫酸化的四糖峰——ΔⅡA-ⅡSglu，猪肝素在2.1％-2.5％之间，而羊肝素是1.7％-2.1％；另外，整体的二糖组成情况看，高硫酸化组份(ΔⅠS、ΔⅡS和ΔⅢS)羊肝素是在80％以上，而猪肝素则最低于78％，羊肝素中硫酸化的程度更高。优选地，所述羊肝素与猪肝素在抗凝活性的差别，全绵羊血浆法抗凝、抗Ⅹa和抗Ⅱa三项上，羊肝素与猪肝素相近，但羊肝素要稍低一下；羊肝素与猪肝素的抗Ⅹa/抗Ⅱa比值上一致，均在0.95-1.05之间。优选地，所述羊肝素与猪肝素在结构上的差别，核磁氢谱上，羊肝素与猪肝素主体一致，但在一些细节结构上相互间有一定的差异，在δ2.04ppm处的氮-乙酰基的甲基峰，羊肝素积分比猪肝素小，反映出羊肝素其中的N-乙酰基修饰较少，对应地，N-磺酸根的修饰比例则更高。达肝素钠，现行各药典规定为猪来源，是以猪精品肝素钠为起始原料，制备方法包括亚硝酸解聚、硼氢化钠还原和分子量分级三个步骤。优选地，羊达肝素钠的制备方法，参照猪达肝素钠的制备方法，但相关工艺参数不同，具体包括如下步骤，S11、亚硝酸解聚，是将上述预处理后的羊肝素溶解，调节溶液pH至酸性，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应，得到解聚液；S12、硼氢化钠还原，是将S11中解聚液的pH调至中性后，加入硼氢化钠，低温下继续搅拌反应，加酸中和多余的硼氢化钠，再加盐和醇沉并干燥得到羊达肝素钠粗品；S13、羊达肝素钠的成品制得，是将S12中得到的羊达肝素钠粗品配制成溶液，以阴离子交换层析(或超滤)进行分子量分级，一种分级方法是采用阴离子交换树脂，是将羊达肝素钠粗品溶液低盐浓度上样，以稍高的盐浓度洗杂，最后以更高的浓度分部收集洗脱，各部分的洗脱产品再以醇沉回收并干燥，均进行分子量及分子量分布分析，经计算后合并适当的组分，纯化水复溶后，0.22μm除菌过滤并冷冻干燥，收获产品；另一种分级方法是将羊达肝素钠粗品溶液以3KDa的超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤后直接冷冻干燥回收，也可以醇沉回收后干燥。优选地，所述S11中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-5之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:20-50，更优选在1:35；所述解聚时间1小时-6小时之间；相对应地，羊达肝素钠制备所用的解聚强度，要比猪达肝素钠制备稍弱一些，以上优选的亚硝酸钠数量更少，pH值更高，解聚时间更短。优选地，所述S12中硼氢化钠还原的温度不能过高，范围在0℃-40℃之间，更优地是在2℃-15℃之间。优选地，所述S12中硼氢化钠的用量与所述S11中羊肝素重量比为1:5-15，更优选为1:10；所述还原时间不低于0.5小时。优选地，所述S13中羊达肝素钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，其特征在于，以上低分子肝素由羊肝素制备得到，以上低分子肝素主要二糖ΔUA2S‑GlcNS6S(ΔⅠS)的含量为66％‑74％。

【技术特征摘要】
1.羊来源的低分子肝素，包括羊达肝素钠、羊那曲肝素钙、羊亭扎肝素钠、羊帕肝素钠和羊贝米肝素钠，其特征在于，以上低分子肝素由羊肝素制备得到，以上低分子肝素主要二糖ΔUA2S-GlcNS6S(ΔⅠS)的含量为66％-74％。2.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，所述羊肝素的抗凝活性全绵羊血浆法折干后不少于150单位每毫克，且3.3％质量浓度的水溶液澄清且色度不深于5号标准色。3.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠抗-Ⅹa活性折干后在100-180单位每毫克之间，抗-Ⅱa活性折干后在30-90单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.6-3.0之间。4.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠重均分子量在5600-6400之间，其中分子量<3000部分的比例不高于13.0％，分子量>8000部分的比例在15.0％-25.0％之间。5.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠羊达肝素钠中羊达肝素糖链中N-乙酰基修饰要少于猪肠粘膜达肝素钠。6.根据权利要求3-5任一项所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法包括如下步骤：S11、亚硝酸解聚，是将权利要求2中的羊肝素用水溶解，调节溶液pH至酸性，然后加入亚硝酸钠，搅拌反应，得到解聚液；S12、硼氢化钠还原，是将S11中解聚液的pH调至中性后，加入硼氢化钠，低温下继续搅拌反应，加酸中和多余的硼氢化钠，再加盐和醇沉并干燥得到羊达肝素钠粗品；S13、羊达肝素钠的成品制得，是将S12中得到的羊达肝素钠粗品配制成溶液，以阴离子交换层析或超滤进行分子量分级，再精制、回收和干燥，得到羊达肝素钠成品。7.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S11中羊肝素用水溶解后的质量比浓度为5-15％，优选为10％；调节溶液pH在2-5之间，优选为2.9-3.3之间；亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:20-50，优选为1:35；搅拌反应的反应时间1-6小时。8.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S12中低温下继续搅拌反应的反应温度为0℃-40℃，优选为2℃-15℃；硼氢化钠的用量与S11中羊肝素重量比为1:5-15，优选为1:10；硼氢化钠还原的还原时间不低于0.5小时。9.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中阴离子交换层析分级时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样时盐浓度控制在300毫摩尔每升以下，上样载量5-50毫克羊达肝素每毫升树脂之内。10.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中分子量分级方法为采用阴离子交换树脂，是将羊达肝素钠粗品溶液低盐浓度上样，以稍高的盐浓度洗杂，最后以更高的浓度分部收集洗脱，各部分的洗脱产品再以醇沉回收并干燥，均进行分子量及分子量分布分析，经计算后合并适当的组分，纯化水复溶后，0.22μm除菌过滤并冷冻干燥，收获产品；另一种分级方法是将羊达肝素钠粗品溶液以3KDa的超滤膜进行至少两个轮次以上的超滤，超滤浓缩液经0.22μm除菌过滤后直接冷冻干燥回收，也可以醇沉回收后干燥。11.根据权利要求6所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊达肝素钠制备方法S13中采用阴离子交换树脂层析分级时，低盐浓度上样的浓度为300毫摩尔每升以下；以稍高的盐浓度洗杂是不高于450毫摩尔每升的盐溶液清洗和平衡已吸附羊达肝素的树脂；以更高的浓度分部收集洗脱是用1摩尔每升以上的高浓度盐溶液洗脱出羊达肝素钠，洗脱液按先后分部收集。12.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙重均分子量在3600-5000之间，其中分子量<2000部分的比例不高于15.0％，分子量2000-8000部分的比例在75.0％-95.0％之间，分子量2000-4000部分的比例在35％-55％之间。13.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙抗-Ⅹa活性折干后在90-125单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在2.0-3.5之间。14.根据权利要求12或13所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法包括如下步骤：S21、亚硝酸解聚，如权利要求6中的S11所述；S22、硼氢化钠还原，如权利要求6中的S12所述，但得到的是那曲肝素粗品；S23、羊那曲肝素钙的成品制得，是将S22中得到的羊那曲肝素粗品配制成溶液后，以阴离子交换树脂吸附，并以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，洗脱液醇沉回收，沉淀物再以纯化水溶解，加入双氧水氧化脱色，脱色液深层过滤，加氯化钙并调节pH至中性，无菌过滤，醇沉回收和干燥，得到羊那曲肝素钙成品。15.根据权利要求14所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法S21中羊肝素的水溶液在5％-15％质量浓度之间，更优选在10％；所述pH调节在2-4之间，更优选pH在2.9-3.3；所述亚硝酸钠的用量与所述羊肝素重量比为1:10-30，更优选在1:20；所述解聚时间1小时-4小时之间。16.根据权利要求14所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊那曲肝素钙的制备方法S23中羊那曲肝素的阴离子交换树脂吸附时，上样浓度在10-100毫克每毫升，上样载量5-50毫克羊那曲肝素每毫升树脂之内；以氯化钙溶液进行低浓度到高浓度的梯度洗脱，是指以不超过400毫摩尔每升的氯化钙溶液清洗和平衡已吸附羊那曲肝素的树脂，再以1摩尔每升以上的高浓度氯化钙溶液洗脱出羊那曲肝素钙，洗脱液按先后分部收集。17.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠抗-Ⅹa活性折干后在60-120单位每毫克之间，抗-Ⅹa/抗-Ⅱa比例在1.5-3.0之间。18.根据权利要求1所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠重均分子量在5500-7500之间，其中分子量<2000部分的比例不高于10.0％，分子量2000-8000部分的比例在60.0％-72.0％之间，分子量>8000部分的比例在22.0％-36.0％之间。19.根据权利要求17或18所述的羊来源的低分子肝素，其特征在于，羊亭扎肝素钠制备方法包括如下步骤：S31、肝素酶Ⅰ解聚，是将权利要求2所述的羊肝素溶于水中得到水溶液，调节溶液pH至中性，然后加入肝素酶Ⅰ，搅拌反应，监控酶解反应直至反应液的232nm吸光度增加值增加至预定范围内，得到羊肝素的酶解聚液；S32、羊亭扎肝素钠的成品制得，是将S31中得到的羊肝素的酶解...

【专利技术属性】
技术研发人员：金永生，靳彩娟，姚亦明，
申请(专利权)人：苏州融析生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32