一种可溶性白细胞介素１５受体α亚单位的原核表达及纯化方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术根据ＧｅｎＢａｎｋ中鼠ＩＬ－１５Ｒα的ｃＤＮＡ序列，设计针对ｓＩＬ－１５Ｒα编码序列的引物对；Ｔｒｉｚｏｌ法提取小鼠脾脏细胞总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ Ｔ为引物合成ｃＤＮＡ第一链，并以此为模板进行ＰＣＲ扩增；ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１８－Ｔｓｉｍｐｌｅ载体连接，得ｐＭＤ１８－Ｔ／ｓＩＬ－１５Ｒα重组质粒，经双酶切后再与表达载体ｐＱＥ－３０连接，获ｐＱＥ－３０／ｓＩＬ－１５Ｒα重组表达质粒，并转化至Ｍ１５感受态细菌；通过降低诱导温度和异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖浓度的方式实现了重组蛋白的可溶性表达，进而通过与Ｎｉ－ＮＴＡ金属螯合柱选择性结合实现了重组蛋白的一步纯化。每升菌中可纯化得到约７ｍｇ重组蛋白，纯度大于９５％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种可溶性白细胞介素15受体a亚单位的原核表达及纯化方 法，属于生物医药
技术背景白细胞介素15 (Interleukin 15,IL-15)是一种与炎症及自身免疫病密切相关 的细胞因子。完整的IL-15受体(IL-15 receptor, IL-15R)是由a、 |3和y三条链 组成的异源三聚体(IL-15RapY)。其中a链(IL-15Ra)是形成高特异、高亲和 力IL-15R的必要亚单位。IL-15Ra是一种I型跨膜蛋白，其基因分别定位于人的第10号染色体和鼠 的第2号染色体上。全长IL-15Ra由263氨基酸残基(amino acid， aa)组成，其 中包括32aa的信号肽，173aa的胞外段，21aa的跨膜段以及37aa的胞内段。在 没有P和Y链参与的情况下，IL-15Ra便可与IL-15高亲和力结合 (Kd=l{rnmol/L)，该亲和力的大小和IL-15Ra|3Y与IL-15之间的亲和力处于同 一数量级。参与受体复合物组成的单一亚单位具有与完整受体复合物相当的、 与相应配体结合的能力，这一不同寻常的特性使IL-15Ra成为近年来免疫学研 究的热门分子。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可溶性白细胞介素15受体a亚单位的原核表达及 纯化方法，我们对鼠IL-15Ra的胞外段，即可溶性IL-15Ra (soluble IL-15Ra, sIL-15Ra)进行了基因克隆、原核表达及初步的生物学活性测定，以期为后续深 入研究创造条件。本专利技术的技术方案 一种可溶性白细胞介素15受体a亚单位的原核表达及 纯化方法，步骤为(1) 引物设计根据已知的GenBank中鼠IL-15Ra的cDNA序列，设计 针对sIL-15Ra编码序列的引物对，在上游引物P1的5 '端引入B"mHI酶切位 点，在下游引物P2的5'端引入^/I酶切位点，酶切位点用下划线标示，弓l物 序列如下Pl， 5 ' -GTAGGATCCGTCACCACGTGACCACCTC-3 '; P2， 5 '國GATGTCGACTATCGTCATTCTCGAACTG画3 ';(2) sIL-15Ra基因克隆及重组表达质粒pQE-30/^tt-"i a的构建将体外 培养的小鼠脾脏细胞用100U/mL干扰素-Y刺激24h，Trizol法提取细胞总RNA，以Oligo T为引物合成cDNA第一链，并以此为模板，用Pl和P2进行PCR扩 增；PCR条件为94°C 5分钟；94°C 15秒，60°C 30秒，72°C 1分钟，30次循 环；72°C 5分钟；PCR产物经电泳分离、割胶回收后，与pMD18-T simple载 体连接，得pMD18-T/s/丄-"及a重组质粒，并转化至TG1感受态细菌，经测序确 证的重组质粒pMD18-T/s/丄-7Ji cc经5awH I和5W/1双酶切，所释放的 基因片段与经同样双酶切的表达载体pQE-30连接，获pQE-30/s/Z-"/ ot重组表 达质粒，并转化至Ml 5感受态细菌，命名为pQE-30/5几-75i o^M15;于含100mg/L 氨苄和100mg/L卡那双抗的固体LB培养基上挑取单个菌落，用PCR和酶切鉴 定；(3) sIL-15Ra的诱导表达挑取经鉴定确证的单菌落，接种于含100mg/L 氨苄和100mg/L卡那双抗的液体LB培养基中，37"C振荡培养过夜，次日，按 1:100比例接种于含100mg/L氨苄和100mg/L卡那双抗的新鲜液体LB培养基中， 37'C振荡培养至A6W值达0.5 0.8，加异丙基-P-D-硫代半乳糖至终浓度为 1.0mmol/L，继续振荡培养，于诱导lh、 3h及5h后分别收集菌液，加等体积 SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min，取10|iL进行SDS-PAGE和Western blot分 析，以转空载体pQE-30的M15菌作为对照；(4) sIL-15Ra的可溶性诱导表达及纯化将pQE-30As/丄-"i aA115菌于 37。C振荡培养至A,值达0.5 0.8，在28。C、 0.5mmol/L异丙基-P-D-硫代半乳 糖条件下诱导培养4h，诱导培养物再经4°C、 lOOOOg离心30 min，收获 pQE-30As/L-/5i a/M15菌体沉淀；用含50mmol/L NaH2P04、 500mmol/L NaCl、 1.0g/L溶菌酶、lmmol/LPMSF， pH8.0的裂解缓冲液lOOmL重悬菌体，冰上放 置30min，超声裂解后，4°C、 10000g离心30 min，收集上清并用0.45pm孔径 滤膜过滤，于上清中加咪唑至终浓度为20mmol/L后，过Ni-NTA亲和层析柱， 用含有40mmol/L、60mmol/L、 100mmol/L咪唑的20mmol/LNaH2PO4、500mmol/L NaCI， pH7.4的洗脱缓冲液，依次洗柱除杂，最后用含500mmol/L咪唑的洗脱 缓冲液洗脱目的蛋白，SDS-PAGE鉴定洗脱目的蛋白的纯度。菌株、细胞与质粒大肠杆菌M15菌株购自德国Qiagen公司，TG1菌株购 自美国Stratagene公司，质粒pMD18-T simple购自TaKaRa公司，质粒pQE-30 为德国Qiagen公司产品。IL-2依赖的小鼠细胞系CTLL-2购自中科院上海细胞 生物学研究所。工具酶、试剂及仪器T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶，M-MLV逆转录 酶，5awHI和I限制性核酸内切酶，Oligo(dT)， DNAmarker DL2000均购自 TaKaRa公司。Trizol为Invitrogen公司产品。小量质粒抽提试剂盒、DNA胶回 收试剂盒、细胞总RNA抽提试剂盒购自华舜生物工程公司。Tryptone和Yeast Extract为Oxford公司产品。羊抗鼠IL-15Ra抗体为R&D公司产品,抗His标签的单抗和Western blotting ECL检测试剂为Santa Cruz公司产品。鼠IL-15和鼠 干扰素-Y购自BioSource公司，重组人IL-2为山东金泰生物工程有限公司产品。 Ni-NTA预装柱(HisTrapFF crude)为GE公司产品。低分子量蛋白标准分别为 上海生工生物工程技术服务有限公司的SM0431和上海生物化学与细胞生物学 研究所产品。RPMI1640为GIBICOL公司产品，小牛血清购自杭州四季青公司。本专利技术的有益效果IL-15最初是作为一种与IL-2具有相似功能的细胞因子 被发现的。随着研究的深入，两细胞因子间的差别日渐显现，其中IL-15所具有 的抗激活诱导的细胞死亡(activation-induced cell death, AICD)作用将其与多种 自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病等)联系了起 来。我们近期的研究也发现，具有显著自身免疫特征的再生障碍性贫血患者的 骨髓基质细胞上同样存在IL-15的异常表达. Int Immunol, 2005; 17: 429-437.]。为了更加深入系统地研究IL-15Ra的独特生物学性状，同时也为了充分地 利用IL-15Ra的独特生物学性状开展一些IL-15靶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可溶性白细胞介素１５受体α亚单位的原核表达及纯化方法，其特征是（１）引物设计：根据已知的ＧｅｎＢａｎｋ中鼠ＩＬ－１５Ｒα的ｃＤＮＡ序列，设计可溶性ＩＬ－１５Ｒα，即ｓＩＬ－１５Ｒα，编码序列的引物对，在上游引物Ｐ１的５′端引入ＢａｍＨⅠ酶切位点，在下游引物Ｐ２的５′端引入ＳａｌⅠ酶切位点，酶切位点用下划线标示，引物序列如下：Ｐ１，５′－ＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣ－３′；Ｐ２，５′－ＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＧＴＣＡＴＴＣＴＣＧＡＡＣＴＧ－３′；（２）ｓＩＬ－１５Ｒα基因克隆及重组表达质粒ｐＱＥ－３０／ｓＩＬ－１５Ｒα的构建：将体外培养的小鼠脾脏细胞用１００Ｕ／ｍＬ干扰素－γ刺激２４ｈ，Ｔｒｉｚｏｌ法提取细胞总ＲＮＡ，以ＯｌｉｇｏＴ为引物合成ｃＤＮＡ第一链，并以此为模板，用Ｐ１和Ｐ２进行ＰＣＲ扩增；ＰＣＲ条件为：９４℃５分钟；９４℃１５秒，６０℃３０秒，７２℃１分钟，３０次循环；７２℃５分钟；ＰＣＲ产物经电泳分离、割胶回收后，与ｐＭＤ１８－Ｔｓｉｍｐｌｅ载体连接，得ｐＭＤ１８－Ｔ／ｓＩＬ－１５Ｒα重组质粒，并转化至ＴＧ１感受态细菌，经测序确证的重组质粒ｐＭＤ１８－Ｔ／ｓＩＬ－１５Ｒα经ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ双酶切，所释放的ｓＩＬ－１５Ｒα基因片段与经同样双酶切的表达载体ｐＱＥ－３０连接，获ｐＱＥ－３０／ｓＩＬ－１５Ｒα重组表达质粒，并转化至Ｍ１５感受态细菌，命名为ｐＱＥ－３０／ｓＩＬ－１５Ｒα／Ｍ１５；于含１００ｍｇ／Ｌ氨苄和１００ｍｇ／Ｌ卡那双抗的固体ＬＢ培养基上挑取单个菌落，用ＰＣＲ和酶切鉴定；（３）ｓＩＬ－１５Ｒα的诱导表达：挑取经鉴定确证的单菌落，接种于含１００ｍｇ／Ｌ氨苄和１００ｍｇ／Ｌ卡那双抗的液体ＬＢ培养基中，３７℃振荡培养过夜，次日，按１∶１００比例接种于含１００ｍｇ／Ｌ氨苄和１００ｍｇ／Ｌ卡那双抗的新鲜液体ＬＢ培养基中，３７℃振荡培养至Ａ↓［６００］值达０．５～０．８，加异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖至终浓度为１．０ｍｍｏｌ／Ｌ，继续振荡培养，于诱导１ｈ、３ｈ及５ｈ后分别收集菌液，加等体积ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上样缓冲液，煮沸５ｍｉｎ，取１０μＬ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析，以转空载体ｐＱＥ－３０的Ｍ１５菌作为对照；（４）ｓＩＬ－１５Ｒα的可溶性诱导表达及纯化：将ｐＱＥ－３０／ｓＩＬ－１５Ｒα／Ｍ１５菌于３７℃振荡培养至Ａ↓［６００］值达０．５～０．８，...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李文新，范俊，杨润琳，邹美芬，蒋孟军，蔡刚明，曹国宪，罗世能，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：32[]
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