渗透压调节基因和蛋白质及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种耐盐基因和蛋白质及制备方法和应用，其具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．１核苷酸序列的耐盐基因和其具有具有ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ．２氨基酸序列的蛋白质，本发明专利技术制备简便，操作方便，该基因在转基因植物中的应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因植物领域，具体地说，本专利技术涉及一种渗透压调节基因，其编码的蛋白质，含有该渗透压调节基因的载体，制备基因、蛋白质、载体的方法，以及该基因在转基因植物中的应用。
技术介绍
随着经济的快速发展，城市化和工业化的进程不断加快，导致高产的良田面积急剧减少。再加上人口的自然增长，因此对粮食和畜产品的消费不断增加。为了满足对农产品日益增长的要求，挖掘中低产逆境农业生态区的农业生产潜力已经势在必行。由于水资源的严重缺乏，我国中低产田的主要特征是干旱和盐渍化，干旱和盐碱化一直是农业中限制植物生长和农作物产量最严重的问题。世界灌溉面积中的一半以上不同程度地受到高盐的影响。全世界盐碱地约有3.8亿hm2。我国就有1亿hm2盐碱地，在现在耕地中约有6700万hm2是盐渍化的低产田，另外还有3333万hm2盐渍化荒草地。例如，地处内陆干旱地区的新疆，有各类盐碱土总面积2181.5hm2，占全国盐碱土面积的22.01％，其中盐渍化土地面积997.1hm2，盐土面积957.0万hm2，碱化土地面积227.3万hm2。目前新疆的407.84万bm2耕地中，受不同盐渍化危害的面积达122.88万hm2，占耕地面积的30.12％，占新疆低产田面积的63.20％。在新疆还有宜农荒地1031.7万hm2，有49.93％即515.11万hm2土地受盐碱制约。传统的盐碱土改良是采用“水利土壤改良”模式，由于排水系统难于保持畅通及上下游排水的互相干扰，改良后的土壤及其周边土地可能出现次生盐渍化问题。改良了一片土地，却又恶化了周边一大片土地环境。特别是大量开垦盐渍化宜农荒地时，区域水资源的承载力是严重不足的。在节水和充分利用高矿化度浅层水用于盐渍化荒地的开垦利用中，开发利用各种抗盐、耐盐的粮食作物、园艺作物、饲草饲料作物、经济作物等，特别是抗逆转基因作物的应用，是保证在资源环境同步良性循环的前提下，求得土地资源开发能获得最大经济效益的关键。许多植物包括耐盐品种，当它们生长在干旱或盐压力下时，常积累相容渗透物质如脯氨酸、甘氨酸甜菜碱和糖醇等来调节胞内渗透压。目前有关渗透压相关基因克隆和在植物中表达方面的研究很多，包括了从植物中克隆的40多个基因，如菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因、转肌醇甲基转移酶基因、拟南芥Δ’-二氢吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)基因等。在已知的相容溶质中，脯氨酸是最广泛存在的渗透物质。植物中的脯氨酸是由谷氨酸经Δ’-二氢吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)和Δ’-二氢吡咯-5-羧酸还原酶(P5CR)两个酶催化而形成的。在水胁迫条件下，植物中脯氨酸水平的调节，主要是发生在翻译水平上，其中P5CS是一限速酶，受到脯氨酸浓度的反馈抑制。因此，脯氨酸含量的提高将导致植物对渗透压耐受能力的提高。有关脯氨酸运输、生物合成和代谢的酶基因已从不同的植物中分离出来，并被转移到烟草中，使转基因烟草在1～2％NaCl的环境中的长势明显优于对照植株。国内也有相关研究报道，如通过在转基因植物中超量表达合成低分子量化合物如甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等的关键酶基因或运输低分子量化合物的载体蛋白基因，使植物获得更强的抗渗透胁迫能力。耐盐微生物在高渗环境的胁迫下，与植物在渗透压保护剂的利用方面惊人地相似，也以合成或从环境中吸收一些低分子量物质来调节自身的渗透压，以平衡外界渗透压的增加。这些低分子量物质包括K+，糖类(如海藻糖，蔗糖等)，醇类，氨基酸(谷氨酸，脯氨酸等)，氨基酸的衍生物(如甜菜碱，肽，氨基酸甲基取代物)等。同样，这些物质在高等生物体内也可作为渗透调节物，起到抗旱、保水、耐盐、耐寒的作用。这表明微生物的渗透压保护物质也能够被用于提高农作物的耐干旱和耐盐能力的遗传工程中。现有报道，E.coli的甘氨酸甜菜碱合成基因betBA已被导入烟草，球形节杆菌(Arthrobacter，globiformis)的生物碱氧化酶基因codA也被整合至拟南芥中，啤酒酵母中扩增得到可调节植物细胞离子均衡的HAL1基因被转化至番茄，分别使这些植物的耐盐能力有所提高。可见微生物有关相容溶质体系的遗传成分，是农业生物技术非常有用的基因来源。但是E.coli和球形节杆菌等本身的耐盐能力有限，因而其相关基因的转入并不能使转基因植物的耐盐能力得到明显提高。但从这些耐盐植物中获得耐盐基因的研究和转基因植物的应用中仍存在很多问题(1)目前发现的耐盐植物和获得的耐盐转基因植物的耐盐能力极为有限，一般不超过盐浓度1～3％，这仅有理论研究意义，离实际应用中还存在较大距离。(2)由于植物中脯氨酸水平受脯氨酸浓度反馈抑制，特别是植物为多细胞结构，使在植物中获得抗反馈调节突变株相当困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从枯草芽孢杆菌中筛选到的渗透压调节基因，含有该基因的植株可适应盐渍化土地的生长。本专利技术的另一个目的是提供一种由渗透压调节基因编码的两种蛋白质。本专利技术的再一个目的是提供一种含有渗透压调节基因的植物表达载体，此重组质粒适于在双子叶植物中表达。本专利技术的再一个目的是提供一种含有渗透压调节基因的植物表达载体，此重组质粒适于在单子叶植物中表达。本专利技术的再一个目的是提供渗透压调节基因在转基因植物中的应用。一种渗透压调节基因，从耐盐微生物中分离，其特征是具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本专利技术以能够耐受14％NaCl的枯草芽孢杆菌CCTCC M93151为基因源，通过PCR方法，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为引物，扩增渗透压调节基因proBA；本专利技术还公开了一种由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码产生的两种蛋白质，其中一种蛋白质具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，另一种蛋白质具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列。具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的对应proB基因含有1113bp，编码一个由370个氨基酸组成的蛋白质分子，蛋白质分子量约为40.7kD。蛋白质同源性比较发现，与枯草芽孢杆菌168的同源性高达90％。将突变株93151-14的proB基因与野生菌株proB基因相比较，发现有3个碱基发生了变化，从起始密码子开始第777位由T变为G，第781位由T变为A，第1087位由T变为C。其中第781位碱基的改变，导致第261位的氨基酸由丝氨酸(Ser)变为苏氨酸(Thr)。而另外两个碱基的改变为沉默位点突变。这个有义突变位点处于推测的活性中心区域以外，据此推测可能γ-GK的催化位点和变构位点是处于全酶的两个不同座位。具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的对应的proA基因长1245bp，编码了415个氨基酸，蛋白质分子量约为45.65kD。蛋白质同源性比较发现，与枯草芽孢杆菌168的同源性高达80％。将突变株93151-14的proA基因与野生菌株proA基因相比较，发现有3个碱基发生了变化，从起始密码子开始第448位由T变为A，第1223位由C变为A，第1235位由C变为G。其中第378位碱基的改变，导致第150位的氨基酸由苏氨酸(Thr)变为丙氨酸(Ala)，第1223位碱基的改变，导致第408位的氨基酸由异亮氨酸(Lle)变为赖氨酸(Lys)，第1235位碱基的改变，导致第412位的氨基酸由谷氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种渗透压调节基因，从耐盐微生物中分离，其具有ＳＥＱＩＤＮｏ．１核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹军卫，苗丽霞，刘瑞杰，王友亮，陈明清，魏红波，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[]