本发明专利技术公开了白菜脱水应答转录因子ＢｐＤＲＥＢ－２基因序列，全长为６４６ｂｐ，具有完整的编码框，编码框全长６３９ｂｐ，位置从第６ｂｐ到第６４６ｂｐ，编码２１３个氨基酸。该基因编码区与油菜中：ＤＲＥＢ２－１９基因（ＡＹ４４４８７７．１）有９７％的同源性，ＣＢＦ７（ＡＦ４９９０３２．１）有９７％的同源性，ＤＲＥＢ２－２（ＡＹ４４４８７４．１）有９２％的同源性。该ＢｐＤＲＥＢ－２基因编码的氨基酸中可预测到转录因子特征结构域ＡＰ２结构域，可以进一步推断所得的基因是ＤＲＥＢ基因家族成员。该发明专利技术为白菜抗逆分子机理研究提供了可靠依据，为转基因抗性植株的获得提供了新的靶基因。
【技术实现步骤摘要】
-本专利技术属于农业生物基因工程
，涉及白菜脱水应答转录因子 基因序列。技术背景-植物对非生物胁迫逆境抗性性状是一种数量性状，是由多种基因控制的综合反 应，通过单基因改良的方式很难提高植物的抗逆性，(Holmberg N等，1998)尤其 对基因组复杂的白菜展开抗逆性研究更为困难。由于一个DREB转录因子可以调控多 个与植物干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因的表达(刘强，2000),在提高植物 对环境胁迫抗性的分子育种中，与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方 法相比，改良或增强一个关键的转录因子，通过它促使多个功能基因发挥作用，获得综 合改良效果，也许是提高植物抗逆性更为有效的方法和途径。(江香梅等，2001)因 此对白菜的抗逆性研究，从克隆转录因子基因入手，进而实行转基因研究，是提高白 菜抗逆性更为有效的方法和途径。通过比较C5尸厶C说。和6S尸3的核苷酸序列发现它们的阅读框(0RF)中没有内 含子插入(吴楚等，2001)。我们使用BLAST程序在Genbank数据库中搜索到的目前 已知的所有DREB转录因子家族成员，发现与抗逆特性相关的转录因子的研究，主要 集中在拟南芥、大麦、黑麦、水稻、油菜等植物上，对白菜转录因子基因的研究则相 对较少。白菜是十字花科芸苔属的基本种之一，它包括重要的蔬菜作物，如结球白菜、不 结球白菜、菜心、曰本京水菜、芜菁以及重要的油料作物，如白菜型油菜、芜菁型油 菜等(张鲁刚等，2000)。由此可见，对白菜抗逆境分子生物学的研究尤其具有实际 意义。本人使用BLAST程序在Genbank数据库中搜索到的目前已知的所有DREB转录 因子家族成员，发现与抗逆特性相关的转录因子的研究，(李华鹏等，2001)主要集 中在拟南芥(刘粉霞等，2004; HaakeV等，2002; NovilloF等，2004)。关于DREB 转录因子的研究越来越受到重视，已经从山菠菜(ShenY. G.等，2003)、大麦(Choi D. W.等，2002)、玉米(Qin F. 2003; 2004)、水稻(Tian X. H.等，2005)、 油菜(Jaglo K. R.等，2001)等不同的植物种克隆出DREB家族成员，并且可以在异源植物中发挥作用，这使DREB基因在植物基因工程上的广泛应用成为可能。
技术实现思路
一种白菜脱水应答转录因子i^/M^^^基因序列，其特征在于属于DREB基因家族 成员，该基因全长646bp，具有完整的编码框，编码框全长639bp，位置从第6bp到 第646bp，编码213个氨基酸。该基因的全长序列为编码 一 个长213aa的多肽，该多肽链的氨基酸序列为LDMEETIVEAIFTEENNDVFYMDEESMLEMPALLASMAEGMLLPPPSVHFGHNYDFDGDADVSLWSYe国内外有文献报道，在十字花科拟南芥及油菜中已分离得到了许多DREB基因家 族，考虑到白菜与油菜有着较近的亲缘关系，本专利技术以十字花科白菜为实验材料，以 期从中分离得到DREB相关基因。根据5个已发表的油菜DREB基因的保守序列设计特 异引物用于扩增白菜中的DREB基因。根据文献报道，DREB基因中不含有内含子，因 此本专利技术以白菜基因组DNA为切入点，可以直接扩增出完整的基因编码框，在一定程 度上提高了目的基因完整编码框的获取几率。 其具体制备方法如下有文献报道(Joaquin Medina, 1999) ， DREB基因中不含内含子。本专利技术从白菜 Brassica pekinesis秋绿60中获得一个DREB基因，它是根据已报道十字花科油菜 的5个DREB基因设计一对特异引物，以白菜基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得的，该基因全长646bp，编码框全长639bp，编码213个氨基酸的多肽。该基因编码 区与油菜中"i fi^-"基因(AY444877. 1)有97%的同源性，(AF499032. 1)有 97%的同源性，"y ^2-i>(AY444874. 1)有92%的同源性。该逸 /Wfi9-^基因编码的氨基 酸中可预测到转录因子特征结构域AP2结构域，可以进一步推断所得的基因是DREB 基因家族成员。1、 所用材料为白菜秋绿60 (Chinese cabbage Qiulv60)。2、 白菜基因组总体DNA利用酚-仿抽提法提取，并通过0.7%的琼脂糖凝胶电泳检 测DNA的纯度和完整性，稀释至25ng/uL ， -20'C保存备用。3、 以白菜基因组DN八为模板，用特异引物F: 5' ATGCGATGACCTCATTTTCT 3'， R: 5' TAATAACTCCAMGGGACAC 3'进行PCR扩增，获得一个长646bp的目标片段，将目标 片段回收、纯化、克隆、测序，其碱基序列为-TCCGTACATTTCGGACATAACTATGACTTTGACGGAGATGCTGACGTGTCCCTTTGGAGTTATTT 3，。4、 BLAST比对，发现该基因与油菜/^^5^-7^基因有97%的同源性；5、 该基因编码一个长213aa的多肽，该多肽链的氨基酸序列为LDMEETIVEAIFTEENNDVFYMDEESMLEMPALLASMAEGMLLPPPSVHFGHNYDFDGDADVSLWSY,6、利用综合的结构域预测网站和NCBI的CDD分析白菜5pZW￡S-2基因编码的氨基酸中可预测到DREB典型的结构域一AP2结构域。进一步确定该基因所属DREB基因家族。附图说明图l DNA样品电泳图；其中M.为DNA历V7dlII+fc0RI Markers; 1. 2为DNA样品 图2为目的基因扩增反应电泳图；其中M.DL2000 Marker 1. 2.为PCR扩增结果， 箭头所指为处ZM^^-a图3为目的基因PCR纯化产物；其中M.DL2000 Marker 1.2.为纯化产物，箭头所 指为^a^fi9-a图4为阳性克隆菌的酶切鉴定； 图5为逸^W^9-2基因的碱基序列； 图6为逸^^￡^-^基因的开放阅读框及氨基酸组成； 图7为InterProScan对白菜逸7M!fi9-2基因的结构域分析结果； 图8为CCD对白菜攻^W^5J基因的结构域分析结果。 本专利技术公开的白菜脱水应答转录因子逸^/ ￡5-2基因序列和编码的氨基酸序列， 与多个DREB转录因子基因有高度的同源性，同时具有DREB转录因子基因典型的AP2 结构域，证明可能是一个有功能的基因。本专利技术为白菜抗逆分子机理研究提供了可靠 依据，为转基因抗性植株的获得提供了新的耙基因。 具体实施例方式为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的 细节影响对本技术方案的描述。以下结合附图对本专利技术白菜脱水应答转录因子 处ZM^S-2基因序列的制备加以进一步说明。 实施例一、白菜秋绿60基因组DNA的提取实验所用的白菜Brassica pekinesis秋绿60种子经10%安替福民消毒、无菌去 离子水反复冲洗后于23'C避光培养7天左右可用。(1) 在5ml离心管中加入2ml提取缓冲液，冰浴备用；(2) 白菜黄化苗0.2g,剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入离心管中，剧烈摇 动混匀，65本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种白菜脱水应答转录因子ＢｐＤＲＥＢ－２基因序列，其特征在于属于ＤＲＥＢ基因家族成员，该基因全长６４６ｂｐ，编码框位置是：６ｂｐ－６４６ｂｐ，该基因的全长序列为： ５’ＡＴＧＣＧＡＴＧＡＣＣＴＣＡＴＴＴＴＣＴＧＣＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡ ＴＧＴＴＧＧＧＣＴＣＣＧＡＧＴＡＣＧＡＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＴＴＡＡＧＣＧＧ ＧＧＡＧＴＡＴＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＴＧＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＴＣＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＣＧＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴ ＣＡ ＣＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＴＣＴＧＡＧＡＡＡＣＴＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＧＧＴＧＴＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡ ＡＧＴＣＴＡＧＧＡＴＴＴＧＧＣＴＣＧＧＴＡＣＴＴＴＣＴＴＡＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＡＧ ＣＴＣＧＴＧＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＡＧＣ ＣＣＴＣＣＧＣＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＴＡＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＡＣＡＴＧＣ ＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＴ ＴＣＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧ ＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＡＡＡ ＡＣＡＡＣＧＡＴＧＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴ ＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＴＧＴＴＡＧＡＧＡＴＧＣＣＧＧＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣＴＡＧＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧ ＴＣＣＧＴＡＣＡＴＴＴＣＧＧＡＣＡＴＡＡ ＣＴＡＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＡＣＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＡＴＴＴ３’。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王振英，彭永康，陈丽媛，刘晓颖，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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