一种探测蛋白之间相互作用的实验方法技术

本发明专利技术提供了一种探测蛋白之间相互作用的实验方法。该技术方案通过蛋白片段释放实验创造性地在细胞微环境下动态探测蛋白之间的相互作用，通过Precision酶切，探测蛋白不同结构域之间的相互作用，这样能够研究蛋白结构域之间的相对较弱的相互作用，为蛋白之间的动态相互作用提供了有效的体外检测手段。本实验以构建可(precision)酶切的MDMXc3与p53蛋白相互作用实验技术方法为例，探查MDMX与p53蛋白之间的动态相互作用，并应用western blot方法进行验证。

An experimental method for the interaction of detecting proteins

【技术实现步骤摘要】
一种探测蛋白之间相互作用的实验方法
本专利技术涉及生物学实验
，具体涉及一种探测蛋白之间相互作用的实验方法。
技术介绍
蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中，生物学中的许多现象如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导和中间代谢等均受蛋白质间相互作用的调控。有些蛋白质由多个亚单位组成，它们之间的相互作用就显得更为普遍。有些蛋白质结合紧密，而有些蛋白质只有短暂的相互作用。然而不论哪种情况，它们均控制着大量的细胞活动事件，如细胞的增殖、分化和死亡。通过蛋白质间相互作用，可改变细胞内蛋白质的动力学特征，如底物结合特性、催化活性；也可产生新的结合位点，改变蛋白质对底物的特异性；还可失活其它蛋白质，调控其它基因表达。因此，只有使蛋白质间相互作用顺利进行，细胞的正常生命活动过程才有保障。由于蛋白质间相互作用具有如此重大的意义，因此其检测方法的研究也备受重视。由生化方法，如蛋白质亲和层析、亲和印迹、免疫沉淀及交联，发展到当今的分子生物学方法，如以基因文库为基础的蛋白探测、噬菌体显示及双杂交系统等。另外，还发展了可定性和定量检测蛋白质间相互作用的简便又快捷的方法，如表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种探测蛋白之间相互作用的实验方法，其特征在于包括以下步骤：1)应用磷酸钙离子转染方法，将可酶切的MDMXc3质粒转染至H1299或U2OS细胞内；2)取1mL免疫沉淀缓冲液充分裂解细胞；3)取1mL步骤2)所得的细胞裂解液，与带有8C6单抗、FLAG单抗、Myc单抗或HA鼠单抗标记的Protein A琼脂糖珠混合，于4℃反应2小时；4)用PreScission缓冲液冲洗琼脂糖珠2～3次，而后将琼脂糖珠悬浮在100μL PreScission缓冲液中；5)向步骤4)所得产物中加入终浓度为0.2μg/μL的PreScission酶，于4℃条件下振荡孵育5～20min；6)将步骤5)所得产物离心1...

【技术特征摘要】
1.一种探测蛋白之间相互作用的实验方法，其特征在于包括以下步骤：1)应用磷酸钙离子转染方法，将可酶切的MDMXc3质粒转染至H1299或U2OS细胞内；2)取1mL免疫沉淀缓冲液充分裂解细胞；3)取1mL步骤2)所得的细胞裂解液，与带有8C6单抗、FLAG单抗、Myc单抗或HA鼠单抗标记的ProteinA琼脂糖珠混合，于4℃反应2小时；4)用PreScission缓冲液冲洗琼脂糖珠2～3次，而后将琼脂糖珠悬浮在100μLPreScission缓冲液中；5)向步骤4)所得产物中加入终浓度为0.2μg/μL的PreScission酶，于4℃条件下振荡孵育5～20min；6)将步骤5)所得产物离心10s，收集固相即为琼脂糖珠；7)将步骤6)收集得到的琼脂糖珠用新鲜的PreScission缓冲液洗一次；8)将步骤7)所得产物与Laemmli样品缓冲液混合后再99℃条件下加热，而后在SDS-PAGE胶上电泳分离蛋白；9)应用纯化的FLAG单抗、Myc单抗、或HA单抗进行westernblot，确定每个蛋白片段的Bound/Supernatant比例；其中所述Bound/Supernatant比例，是同琼脂糖珠结合的蛋白量、释放至溶液中的蛋白量这二者的比例。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：魏玺，高明，陈建东，
申请(专利权)人：天津市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：天津,12