超氧化物歧化酶衍生物制备方法及医学上的应用技术

一种新的超氧化物歧化酶衍生物，这种衍生物具有分解超氧化物的酶活力，超氧化物是对机体有害的物质．本发明专利技术所提供的超氧化物歧化酶衍生物在血浆中的半寿期大大长于超氧化物酶本身，而且保留大部分酶活力．这种物质有药理学的活性，例如具有对炎症、局部出血损伤、大脑水肿等的保护作用．本发明专利技术还提供了制造这种超氧化物歧化酶衍生物的一种方法及其在医疗上的应用．（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及超氧化物歧化酶衍生物，制备方法及医学上的应用。超氧化物歧化酶(在下文中缩写为SOD)一直被认为广泛存在于生物体中的一种酶，如动物、植物和微生物中都有，具有分解超氧化物的能力，超氧化物是一种对有机体有害的化合物。最近，人们试图利用被分离的SOD作为抗炎症药物〔Farumashia，17，411(1981);Current Therapeutic Research，16，706(1974)〕。SOD用在对难治疗的辐射引起的结肠炎或在予防和治疗胃溃疡病方面已有研究〔Jikken Igaku(Experimental Medicine)，4(12)，39(1986)〕。从下面叙述的实验结果很清楚，人型SOD实际上缺乏抗炎症的活性，而且抗溃疡的活性很弱。据说，当静脉给予SOD在血浆中的半寿期仅4-6分钟;SOD迅速被代谢并排泄到尿中。为延长SOD在血浆中的半寿期，试图用聚蔗糖，聚乙二醇或大鼠清蛋白进行修饰，将SOD转变为大分子。但是，利用聚蔗糖或聚乙二醇修饰的SOD，酶活力大大降低，而大鼠清蛋白修饰的SOD有抗原性。曾报导，菊粉修饰的SOD跟未修饰的SOD比，降低了SOD的活力，却大大延长了它在血浆中半寿期〔Japanese Kokai Tokkyo Koho No.58-32826〕。但是，这些修饰的SOD或由于上述原因或由于其分子体积增大，使在组织中的穿透力降低，在实际应用中均有问题。本专利技术的目的是提供新的超氧化物歧化酶衍生物，这种衍生物在血浆中半寿期比SOD大大延长，保留绝大部分SOD的酶活力，不增加SOD的分子大小。本专利技术的另一个目的是提供新的、安全的超氧化物歧化酶衍生物，它具有药理学活性，如抗炎症，防止局部出血损伤，予防大脑水肿等作用。本专利技术的第三个目的是提供生产上述超氧化歧化酶衍生物的方法。本专利技术的第四个目的是提供此超氧化物歧化酶衍生物作为药物的应用，例如作为抗炎症药物，抗局部出血损伤的保护剂以及用于治疗大脑水肿的药物。本专利技术中的这些目的及其他目的和优点，将在下面详述中使本专业技术人员更清楚地了解。本专利技术提供具有如下通式的超氧化物歧化酶衍生物〔SOD〕〔Z〕x式中〔SOD〕是超氧化歧化酶残基，含1-6个基团，每个基团是从氨基衍生的，通过在相应的氨基上除去一个氢原子后所衍生的，〔Z〕是由下列组份单位组成的一价共聚物残基(a)从下列组成的基团中选择的一种基团 其中R1，R3和R5分别是氢原子或甲基;R2是氢原子、氯原子、溴原子或甲基;R4是氢原子或含1-5个碳原子的烷基;R6是甲基或乙基。(b)具有如下通式的基团 其中R7是氢原子或含1-4个碳原子的链烷醇，乙二醇单烷基醚(其烷基含1-4个碳原子)或是甘油二烷基醚(其烷基各含1-4个碳原子)，作为除去羟基后生成的产物。(c)具有如下通式的基团 其中羰基的碳原子通过〔SOD〕氨基的氮原子结合到〔SOD〕上，共聚物残基具有平均分子量为800-20，000和X是1-6的整数，相当于SOD的基团数目，每个SOD基团是由除去一个氢原子后的氨基衍生来的〔在下文中超氧化物歧化酶衍生物称为SOD衍生物〕。本专利技术也提供了生产上述SOD衍生物的方法，此方法包括使SOD与下列组份单位组成的共聚物(其平均分子量为800-20000)在碱性水溶液中PH为7-11相反应，组份单位如下(a)从下列组成基团中选择的基团， 其中R1，R2，R3，R4，R5，R6如上所规定;(b)具有如下通式的基团 其中R7如上所规定;(c)具有如下通式的基团 本专利技术进一步提供以SOD衍生物作为主要成份的药剂和药用组合物。在附图中，图1表明在SOD和Bu-SMA(部分半丁酯化的苯乙烯-马来酸酐共聚物;在下文中将同样使用)反应的情况下，SOD中所含TNBS-可滴定氨基减少的百分数和反应时间的关系。Bu-SMA将在合成例3中叙述;图2表明合成例1和合成例2中分别所得的SOD衍生物和起始材料SOD的紫外吸收光谱;图3表明在实验例5所得的反应混合物中Bu-SMA浓度和所得的SOD衍生物中TNBS-可滴定氨基含量之间的关系，以及此Bu-SMA浓度和SOD衍生物中SOD活性之间的关系;图4(1)表明人红血球SOD的红外光谱;图4(2)表明牛红血球SOD的红外光谱;图5、图6、图7分别显示了在合成例7-1，7-2，7-3中分别所得的SOD衍生物的红外光谱;图8表明合成例1用51Cr标记后所合成的SOD衍生物，按给定的PH和放射性下等电聚焦的实验结果;图9表明在合成例2中用51Cr标记后所得SOD衍生物按给定的PH和放射性下等电聚焦的实验结果;图10表明按合成例2所得的SOD衍生物和开始材料的SOD经牛血清清蛋白-琼脂糖凝胶柱亲和层析的结果;图11表明按合成例2所得的SOD衍生物和起始材料SOD本身耐各种蛋白酶水解的比较;图12表明按合成例2所得的SOD衍生物和起始材料SOD大鼠静脉给药后，在血浆中的浓度随时间变化的过程;图13表明SOD衍生物和Bu-SMA静脉给药后，小鼠股骨肌中不同时间的蓄积过程，予先将0.2ml的HEPES缓冲液(PH6.0)肌肉注射到小鼠左侧股骨肌(酸性侧面)，0.2ml生理盐水注射到右侧股骨肌(对照侧面);图14表明SOD衍生物对大鼠强制性浸水形成急性胃粘膜损伤的抵抗能力的实验中所得的溃疡指数(mm/组织)和浸水时间之间的关系;图15(1)表明SOD衍生物在诱导产生水肿的大鼠右侧大脑半球(损伤侧面)，左侧大脑半球(完整侧面或对照侧面)以及血浆中的蓄积;图15(2)表明Bu-SMA在上述相同大鼠的损伤侧面、完整侧面和血浆中的蓄积;图16表明小鼠用农药百草枯处理后，给SOD衍生物和仅用百草枯处理不给SOD衍生物(对照组)，处理时间和血浆中GOT水平的关系。现就按本专利技术产生SOD衍生物的方法作详细说明。SOD与共聚物的反应一般按以下方法进行，将SOD溶解在一种盐的水溶液中，这种盐可以是碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸钠等，再加入共聚物，可以粉末状或溶于有机溶剂(如二甲亚砜等)的形式加入。反应期间，溶液PH维持在7-11。PH低时，共聚物溶解度降低，反应不能进行。当PH高于11时，SOD的酶活力丧失，得不到本专利技术中的SOD衍生物。反应温度选在3°-50℃为宜，最好在3-40℃。反应时间取决于温度和共聚物加入的方式，但一般为10分钟至3小时。共聚物的所用量是每摩尔SOD约0.5-30摩尔。共聚物结合到每个SOD分子上的分子数目，可以通过在上述范围内改变共聚物的量加以调节。如此所得的反应混合物中，含有SOD衍生物、未反应的SOD及共聚物等。将此反应混合物过滤，滤液经过凝胶过滤。如必要，所得的含SOD衍生物的洗脱液再进行疏水层析，再超滤浓缩。冻干得固体SOD衍生物。在上述反应中，SOD的氨基和共聚物的马来酸酐环起反应，形成SOD衍生物。例如，人型Cu.Zn-SOD每分子含22个氨基(在人红血球的SOD，或利用基因工程通过酵母产生人型SOD的情况下)或每分子含24个氨基(在用基因工程方法通过大肠杆菌产生人型SOD的情况下)。上述反应中SOD的任何一个氨基，都能和共聚物的马来酸酐环起反应，生成的SOD衍生物中，每个SOD分子结合1-6个共聚物本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有如下通式的超氧化歧化酶衍生物，［ＳＯＤ］［Ｚ］↓〔ｘ〕其中［ＳＯＤ］是超氧化歧化酶残基，此残基含１—６个基团，每个基团是由氨基衍生的，通过在相应的氨基上除去一个氢原子后所衍生的，［Ｚ］是一个单价共聚物残基，由以下组份单位组成：　 　（ａ）从下列组成的基团中选择的一种基团：＊＊＊，＊＊＊，＊＊＊其中Ｒ↑〔１〕，Ｒ↑〔３〕和Ｒ↑〔５〕是氢原子或甲基，Ｒ↑〔２〕是氢原子、氯原子、溴原子或甲基，Ｒ↑〔４〕是氢原子或含１—５个碳原子的烷基，Ｒ↑〔６〕是甲基或乙基； （ｂ）具有如下通式的基团：＊＊＊其中Ｒ↑〔７〕是氢原子或含１—４个碳原子的链烷醇残基、乙二醇单烷醚（其烷基含１—４个碳原子）或甘油二烷醚（其每个烷基含１—４个碳原子）作为除去羟基后生成的产物；（ｃ）具有如下通式的基团：＊＊＊ 其中羰基碳原子通过［ＳＯＤ］的一个氨基氮原子结合到［ＳＯＤ］上；共聚物残基具有平均分子量８００—２０，０００，Ｘ是１—６的整数，相当于［ＳＯＤ］基团的数目，每个ＳＯＤ基团是通过氨基上除去一个氢原子后所衍生的。

【技术特征摘要】
JP 1986-5-16 113095/86;JP 1987-2-27 45666/871.具有如下通式的超氧化歧化酶衍生物，[SOD][Z]x其中[SOD]是超氧化歧化酶残基，此残基含1-6个基团，每个基团是由氨基衍生的，通过在相应的氨基上除去一个氢原子后所衍生的，[Z]是一个单价共聚物残基，由以下组份单位组成(a)从下列组成的基团中选择的一种基团其中R1，R3和R5是氢原子或甲基，R2是氢原子、氯原子、溴原子或甲基，R4是氢原子或含1-5个碳原子的烷基，R6是甲基或乙基；(b)具有如下通式的基团其中R7是氢原子或含1-4个碳原子的链烷醇残基、乙二醇单烷醚(其烷基含1-4个碳原子)或甘油二烷醚(其每个烷基含1-4个碳原子)作为除去羟基后生成的产物；(c)具有如下通式的基团其中羰基碳原子通过[SOD]的一个氨基氮原子结合到[SOD]上；共聚物残基具有平均分子量800-20，000，X是1-6的整数，相当于[SOD]基团的数目，每个SOD基团是通过氨基上除去一个氢原子后所衍生的。2.生产具有下列通式的超氧化物歧化酶衍生物的方法，〔SOD〕〔Z〕x其中〔SOD〕是超氧化物歧化酶残基，含1-6个基团，每个基团是在相应的氨基上除去一个氢原子后衍生的，〔Z〕是一个单价的共聚物残基，由以下组份单位组成(a)从以下组成的基团中选择的一种基团其中R1，R3和R5各为氢原子或甲基，R2是氢原子、氯原子、溴原子或甲基，R4是氢原子或含1-5个碳原子的烷基，R6是甲基或乙基;(b)具有以下通式的基团其中R7是氢原子或含1-4个碳原子的链烷醇残基、乙二醇单烷醚(其烷基含1-4个碳原子)或甘油二烷醚(其每个烷基含1-4个碳原子)作为除去羟基后生成的产物;以及(c)具有以下通式的基团其中羰基碳原子通过〔SOD〕的一个氨基氮原子结合到〔SOD〕上，共聚物残基具有平均分子量800-20，000，X是1-6的整数，相当于〔SOD〕基团的数目，每个SOD残基是通过在氨基上除去一个氢原子后衍生的，它包括超氧化物歧化酶与由下列组份单位所组成的共聚物(其平均分子量为800-20000)，在碱性水溶液中PH为7-11起反应，组份单位如下(a)从下列通式组成的基团中选择一种基团，其中R1，R2，R3，R4，R5和R6如上所规定，(b)具有以下通式的基团其中R7是按如上所规定，以及(c)具有以下通式的基团3.根据权利要求2的方法，其中超氧化物歧化酶是人型超氧化物歧化酶或牛型超氧化物歧化酶。4.根据权利要求2的方法，其中超氧化物歧化酶是人红血球超氧化物歧化酶或牛红血球超氧化物歧化酶。5.根据权利要求2的方法，其中多聚物是选自下列部分水解后的基团，苯乙烯-、对-氯苯乙烯-、对-溴苯乙烯-或α-甲基苯乙烯-马来酸酐共聚物;部分半酯化的苯乙烯-、对-氯苯乙烯-、对-溴苯乙烯或α-甲基苯乙烯-马来酸酐共聚物;部分水解的乙烯-、丙烯-、α-丁烯-、异丁烯-、1-戊烯-、2-甲基-1-丁烯-、1-己烯-、1-庚烯-马来酸酐共聚物;部分半酯化的乙烯-、丙烯-、α-丁烯-、异丁烯-、1-戊烯-、2-甲基-1-丁烯-、1-己烯-、或1-庚烯-马来酸酐共聚物;部分被水解的醋酸乙烯酯-马来酸酐共聚物;部分半酯化的醋酸乙烯酯-马来酸酐共聚物;部分水解的(甲基)丙烯酸甲酯-马来酸酐共聚物;部分半酯化的(甲基)丙烯酸甲酯-马来酸酐共聚物;部分水...

【专利技术属性】
技术研发人员：井上正康，荻野哲也，森野能昌，广田昌彦，
申请(专利权)人：井上正康，可乐丽股份有限公司，
类型：发明
国别省市：JP[日本]