植物组织转化制造技术

本发明专利技术提供一种转化植物材料的方法，该方法包括在电流存在下，使材料与含有ＤＮＡ和膜通透剂的转化溶液接触足以进行转化的一段时间，本发明专利技术还提供如此获得的植物材料和可育植株。本发明专利技术还提供新的转化的植物材料，特别是玉米。（*该技术在2008年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及利用DNA转运电流将DNA导入单子叶植物和双子叶植物细胞的方法。该方法将质粒DNA直接转移到完整的单子叶和双子叶组织中。植物的遗传转化一直采用两种不同的方法进行。但是在应用于单子叶植物，尤其是有商业价值的作物如谷类作物时，这两种方法都受到限制。第一种方法依赖于农杆菌属(Agrobacterium)的土壤微生物中诱瘤(Ti)质粒的一个区域在该细菌感染寄主后与寄主细胞基因组融合的能力。因而该质粒的遗传操作可使外源DNA导入寄主细胞。但因为单子叶植物一般对这种微生物不敏感，所以该方法仅限于双子叶植物的转化。尽管用这种方法进行天门冬属(Asparagus)的遗传转化已经公开(WO86/03776)，并已有通过农杆菌将DNA转移到谷类作物中的报导(Grimsleyetal.，Nature，325(1987)，177)，但还未证实确实可以发生转化，即寄主细胞基因组吸收并整合了外源DNA或表达了所期望的新性状。第二种方法是通过植物原生质体直接吸收核酸。这种吸收可以采用化学方法，即用聚乙二醇促进吸收(Paszkowskietal.，Meth.Enzym.118(1986)，668)，或采用微秒持续高压电脉冲来完成。后一项技术称为电穿孔或电注射，它的作用可能是通过在植物细胞膜上穿出暂时的缝隙，使外来核酸能顺利通过细胞膜。参见例如Frommetal.，PNAS82(1985)，5824;Frommetal.，Nature319(1986)，791和WO87/06614。但这种方法成功与否取决于原生质体再生成熟可育植株的能力。目前证明谷类作物中仅有水稻有这种能力。有人试图将玉米原生质体再生为可育植株(Gravesetal.，Theor.Appl.Genet.54(1979)，209)，但这些努力尚未取得成功。用电穿孔方法将裸露的RNA转移到双子叶植物细胞中也已进行了研究。已证实烟草花叶病毒(TMV)的RNA可被烟草属(Nicotiana)双子叶植物的完整叶肉细胞吸收(Morikawaetal.，Gene41(1986)，121)。但据述该方法用于个体细胞时，所产生的细胞成活率很低，并且尚未清楚地证实寄主细胞是被转化而不是被感染。进一步，即使将来能成功地进行个体单子叶细胞的电穿孔，也仍将存在从个体细胞再生完整植株的问题，尤其是再生可育的玉米植株。叙述本专利技术时欲采用的术语是根据其本领域内通用的含意。对于没有通用含意或含意不清的，可对照下列定义“电转化”是利用一种持久的、连续的直流电流诱导寄主或受体细胞吸收DNA并随后将该遗传物质整合到寄主细胞基因组中;“植物组织”指细胞群体;“胚胎”是指特定器官或器官系统如根和茎进行不可见分化，但存在将产生各种器官的细胞层这样一个发育阶段;“愈伤组织”是指由单个植物细胞或组织经组织培养产生的植物细胞群;“CM(30)”是一种人工玉米培养基，其成分示于表A;“MTM”是一种用于培养玉米雄花穗的人工液体培养基，其成分如文献所述(Pareddy，GreysonandWalden;Planta170(1987)，141);“BSS”是一种用于芸苔属茎条(stemstrips)的人工液体培养基，其成分示于表B。“TMM”是一种培养蕃茄胚胎的人工培养基，其成分示于表B。“原生质体”是指除去了细胞壁(通常是用酶消化)，但仍包有细胞膜的植物细胞;“分生组织”由能够充分地进一步分裂的细胞组成，转而产生胚性的初生组织或次生组织;“基因组”在此用来指一个细胞内所存在的全部遗传物质，包括染色体和染色体外的遗传物质;被DNA“转化的”细胞是指含有该DNA的细胞，或其通过有丝分裂或减数分裂产生的、在其基因组中仍保留该DNA顺序的子代细胞。“膜通透”剂指用于哺乳动物细胞的膜通透剂。本专利技术涉及一种转化植物细胞材料的方法，包括在电流存在下，使该细胞材料与含有DNA和细胞膜通透剂的转化溶液接触足以进行转化的一段时间。本专利技术的方法具有许多优点。它能够穿透多层细胞，因而可以采用整个组织而非单个细胞。细胞不受损伤，它们保留其生活力并能用来产生成熟可育植株。该方法还能够转化以前尚未成功转化的植物。本专利技术还涉及产生转化的可育植株的方法，包括在电流存在下，使植物细胞与含有DNA和细胞膜通透剂的转化溶液接触足以进行转化的一段时间，并在培养条件下培养如此转化的植物细胞。为了区别本专利技术的转化方法与利用短脉冲(一般为几微秒至约400毫秒的数量级)电流的所谓电穿孔或电注射技术，将这种转化方法定义为电转化。这样，本专利技术利用更恒定、施加时间更长的电动势(电压)，将DNA运载或转运至细胞膜并通过细胞膜。利用膜通透剂可有效地增强细胞膜的通透性。任何植物材料都可用于本专利技术的电转化。例如，本专利技术可设想植物组织、植物胚胎、分生组织如雄花穗或穗分生组织、腋芽、茎条、愈伤组织或细胞悬浮液的转化。如果用玉米胚胎组织，该胚胎最好已到达Abbe和Stein(Am.J.Botany，41(1954)，286-287)所定义的发育阶段3，即处在授粉后22至28天之间的一个阶段。处在阶段3的玉米胚一般约为3mm长，盾片节组织可由两个将其分开的缢痕而从外部分辨。在胚根鞘内，初生根已可辨认;在胚芽鞘内，第一叶片和第二叶片已显著增大。这个时期的特征是第三叶原基刚刚出现。所用的植物材料处于便于操作的离体形式。本专利技术的方法便于在水平凝胶电泳系统例如琼脂糖凝胶电泳系统中实施，在该系统中，将所要转化的植物材料和DNA置于样品孔内，使电流能从DNA流向植物材料。如用胚胎组织，该胚胎置于样品孔内时，最好使含有分生组织的一侧对着含有转化溶液的样品孔。然后将含有DNA(为便于后期选择，该DNA可含有，例如一段编码特定抗生素抗性的DNA顺序)和膜通透剂的溶液置于含有植物细胞材料的样品孔附近的样品孔内。膜通透剂最好是极性的，以便施加电压时可将其与DNA一起运载至细胞膜并穿过细胞膜。合适的极性膜通透剂的例子包括DMSO、溶血卵磷脂、去污剂如十二烷基硫酸钠和去利通-X，最好是DMSO。所用的这种膜通透剂的浓度应足以使细胞膜具有暂时的通透性但不破坏细胞内细胞器膜的完整性。这种浓度可在很大范围内变化，并将取决于所涉及的植物材料。较坚硬的植物细胞材料如双子叶细胞材料，可承受例如浓度为10%的DMSO。一般来说，按转化溶液的重量计算，膜通透剂的浓度为约1%-4%，最好约2%时，能得到良好的结果。转化溶液中可任意地含有一种示踪染料以便能监测载体的进程。合适的示踪染料的例子可以是溴酚蓝、溴甲酚绿或二甲苯苯胺(xylenecyanol)。这些染料及它们在这方面的应用在本领域内是熟知的。施加低压电流，使其流动的方向从含有载体的样品孔流向含有植物材料的样品孔。此后，将该组织用无菌液洗涤并放于固体培养基上，以便使其在电转化过程中所致的所有损伤得到恢复。在固体培养基上放置时间的长短取决于所处理的组织的年龄和大小，较年幼的和/或较小的组织在选择步骤之前可能需要较长的恢复期。通常将组织在培养基上保持2-3天，然后对成功转化的组织进行选择。如果转化载体上含有编码特定抗生素抗性的DNA顺序，则可通过将该组织与这种特定抗生素接触来进行选择。有些组织在选择培养基上萌发(对于胚胎来说是生根发芽)或生长，并产生叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转化植物细胞材料的方法，包括在电流存在下，将该细胞材料与含有ＤＮＡ和一种膜通透剂的转化溶液接触足以使ＤＮＡ转运至植物材料并产生转化的一段时间。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：沙伦克拉丽斯哈维阿尔菲尼托，保罗沙泽迪特里希，林艾伦默里，拉尔夫迈克尔辛尼巴尔迪，
申请(专利权)人：山道士有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]