昆虫病毒、其序列、杀昆虫组合物及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种能够比以前的病毒更快地杀灭至少一种靶有害昆虫的昆虫病毒，以及赋予这种更快杀灭表型的ＤＮＡ序列。杀灭速度的进一步提高还可以在本发明专利技术的病毒含有无功能的ｅｇｔ基因以减少受感染幼虫的摄食、抑制生长和进一步介导受感染昆虫的更早死亡时获得。一种具体的更快杀灭的昆虫病毒是ＡｃＭＮＰＶ Ｖ８株。更快杀灭表型由ＡｃＭＮＰＶ基因组中１．９３－３．２７图距单位的ＭｌｕＩ至ＥｓｐＩ片段携带，其序列在ＳＥＱＩＤ．ＮＯ：＿中提供。Ｖ８ｖＥＧＴＤＥＬ是ＡｃＭＮＰＶ Ｖ－８的ｅｇｔ－失活衍生株；将Ｖ－８基因型的更高毒性和编码蜕皮甾类葡糖基转移酶基因的失活结合起来，可进一步提供（如感染后至死亡时间更短）。此外，这种ｅｇｔ缺陷杆状病毒可进一步改良以病毒影响蜕化的蛋白质。在本发明专利技术中还包括了产生这种更快杀灭的昆虫病毒的方法、改良的杀虫剂组合物和改良的防治昆虫的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及使用杆状病毒及其序列以更好地生物防治有害昆虫的方法和组合物。更具体地，本专利技术涉及在昆虫防治方面具有更好性能的重组的杆状病毒，以及来自该病毒的赋予更佳性能(即使至少一种靶昆虫更快死亡)的片段。本专利技术还涉及基因修饰的、杀灭性能进一步改善的杆状病毒及其使用方法。
技术介绍
由于常规的化学杀虫剂存在缺点，所以导致了对生物防治有害昆虫的兴趣。化学杀虫剂一般会影响有益或有害种类。有害昆虫会获得对这些化学品的抗性，从而会很快地形成新的、抗这些杀虫剂的有害昆虫群。此外，化学残留物会产生环境危害并可能导致健康问题。生物防治是另一种害虫防治方式，它降低了对化学杀虫剂的依赖性。主要的生物防治策略包括运用天然存在的、使昆虫致病的生物体(昆虫病原体)和开发更抗有害昆虫的作物。方法包括鉴别和定性可作为昆虫防治剂的合适靶目标的昆虫基因或基因产物、鉴别和开发先前未使用过的微生物(包括修饰天然存在的非致病微生物以使它们对昆虫致病)、修饰和优化目前使用的昆虫病原体、以及开发对有害昆虫抗性更高的基因工程作物。在昆虫群中造成天然家畜流行病的病毒是已开发作物生物杀虫剂的昆虫病原体中一部分。杆状病毒是一大类仅感染节肢动物的病毒(Miller，L.K.(1981)Genetic Engineering in the Plant Science，N.Panopoulous，(ed.)，Praeger Publ.，NewYork，pp.203-224；Carstens，(1980)Trends in Biochemical Science 52107-110；Harrap and Payne(1979)Advances in Virus Research，Vol.25，Lawfer et al.(eds.)，Academic Press，New York，pp.273-355；The Biology of Baculoviruses，Vol.I andII，Granados and Federici(eds.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1986.)。许多杆状病毒感染昆虫，而这些昆虫是重要经济农业作物和森林作物的害虫。这样的杆状病毒具有作为生物防治剂的潜在价值。四种不同的杆状病毒已由美国环境保护局登记作为杀虫剂使用。在杆状病毒作为生物杀虫剂的众多优点中有一点是其宿主特异性。不仅作为一类的杆状病毒只感染节肢动物，而且各杆状病毒株一般只感染一种或几种昆虫。因此，它们不会对人或环境造成危害，而且使用时也不会危害有益的昆虫种类。包括AcMNPV在内的杆状病毒，已经发现在约400个跨几个不同昆虫目的不同种中，绝大多数的这些病毒存在于鳞翅目中。已知杆状病毒感染天然生态系统(如森林和草原)和单一培养物的农业生态系统(如棉花田)中的昆虫。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclear polyherosisvirus，AcMNPV)是已知的最彻底定性的杆状病毒。AcMNPV属于杆状病毒科(Baculoviridae)，真杆状病毒亚科(Eubaculovirinae)，核型多角体病毒(NuclearPolyhedrosis Virus)属，和多核壳病毒(Multiple Nucleocapsid Virus)亚属，其特征是在受感染的宿主细胞的核中形成病毒包含体(或多角体(polyhedra))。该病毒最初是20多年前，在加利福尼亚州天然发生的家畜流行病感染中从苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)中分离到的。之后，用生物化学和分子技术对该病毒进行广泛地定性，从而知晓了128kbp基因组中的全部DNA序列。AcMNPV已被指定为多核壳病毒亚属的模式种。杆状病毒亚群包括核型多角体病毒(NPV)、颗粒体病毒(granulosis virus，GV)、和无包含体杆状病毒。在包含体形式的杆状病毒(GV和NPV)中，病毒颗粒(有包膜的核壳)被嵌在结晶的蛋白质基质中。这种结构被称为包涵体或包含体，它是自然界中在生物体外发现的形式，它专司在生物体之间扩散感染。NPV的特征是在每个包含体中嵌有许多病毒颗粒。NPV包含体相对较大(可达5微米)。GV病毒的包含体较小，每个只含有一个病毒颗粒。两种形式包含体的结晶蛋白质基质主要由单个25,000-33,000道尔顿的多肽(称为多角体蛋白(polyhedrin)或颗粒体蛋白(granulin))构成。无包含体亚群的杆状病毒不产生多角体蛋白或颗粒体蛋白，而且也不形成包含体。在自然界，当昆虫摄入被杆状病毒颗粒(对于NPV如AcMNPV通常是包含体形式)污染的食物时，感染便开始了。包含体在昆虫中肠的碱性条件下发生解体，释放出各病毒颗粒，这些病毒颗粒接着侵入肠道中的上皮细胞。在宿主细胞中，杆状病毒迁移至细胞核，在此处发生复制。起初，在受感染的细胞中通过所谓的“早期基因”的转录和翻译而产生一些特定的病毒蛋白。在其他功能中，需要这些蛋白复制病毒DNA，这在病毒进入细胞后4-6小时开始。最久在感染后(post-infection，pi)24小时左右，进行全部的病毒DNA复制。在感染后约8-20小时，受感染细胞产生大量“晚期病毒基因产物”。其中包括核壳的组份，核壳在形成子代病毒颗粒时将病毒DNA包裹起来。子代病毒颗粒的产生在感染后约12小时开始。最初，子代病毒迁移至细胞膜，在此处当它们从细胞表面出芽时获得包膜。这种无包含体的病毒可接着感染昆虫的其他细胞。在感染后约18小时开始合成多角体蛋白，并且在感染后24小时增加到非常高的水平。此时，出芽病毒颗粒的数目下降，而且子代病毒被嵌入包含体。包含体形成继续进行，直至细胞死亡或裂解。某些杆状病毒可几乎感染宿主昆虫中各种组织，所以在感染过程结束时，整个昆虫被液化，释放出极多的包含体，而这些包含体又将感染扩散给其他昆虫。(参见The Biology of Baculoviruses，Vol.I and II，Granados and Federici(eds.)，CRC Press，Boca Raton，Florida，1986.)。随着幼虫生长和成熟，它会越来越抗病毒感染。成虫组织和蛹组织似乎抗病毒感染。AcMNPV感染的主要方式似乎是通过横向传播。昆虫一般是通过摄入被污染的食物而获得AcMNPV。包含体在昆虫中肠中解体并释放出病毒颗粒，从而在中肠细胞中形成感染的最初位点。AcMNPV在环境中生存和传播的能力受多种相关因素的制约(参见Evans，H.(1986)The Biology of Baculoviruses，Ecology and Epizoology of Baculoviruses，Granados，R.R.and Federici，B.A.(eds.)pp.89-132)。诸如昆虫对病毒的相对敏感度以及受发育程度确定的对AcMNPV的敏感度等因素是重要的。宿主密度似乎也在确定杆状病毒的生存和传播方面起重要作用。在确定AcMNPV环境传播和持续性的生物和非生物因素中，存在重要的密切关系。例如，捕食动物与病毒、竞争可供的昆虫宿主，并且通过从环境中去除这些病毒易感宿主而降低潜在的病毒生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的ＤＮＡ分子，其特征在于，它含有图４中从核苷酸３００２－４２３１的Ｖ－８序列的核苷酸序列，其中当该核苷酸序列被整合入昆虫病毒基因组中时该核苷酸序列会赋予更快杀灭至少一种有害昆虫的性能。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：LK米勒，NC弗莱明，BC布莱克，F艾哈迈德，PM德克斯，
申请(专利权)人：美国氰胺公司，佐治亚大学研究基金会股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]