一种检测蛋白质的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测蛋白质的方法，包括如下步骤：(1)将蛋白质样品进行变性处理，然后向变性处理后的蛋白质样品中加入丹磺酰氯溶液，30‑50℃下放置20‑120min；(2)配制SDS‑PAGE，加入步骤(1)处理后的蛋白质样品，进行凝胶电泳操作；(3)电泳完成后，将蛋白胶置于紫外灯或LED灯下观察，直接得出检测结果。本发明专利技术利用丹磺酰氯对蛋白质样品进行荧光标记处理，处理样品与SDS‑PAGE的配制同步进行，电泳后无需再进行染色和脱色的步骤，与现行的检测方法相比，大大缩短了实验时长，减少了实验复杂度。

【技术实现步骤摘要】
一种检测蛋白质的方法
本专利技术涉及蛋白质检测
，具体涉及一种新的检测蛋白质的方法。
技术介绍
在生命科学研究领域中，离不开对生命的基本物质蛋白质和DNA的研究，也就离不开对蛋白质的检测技术。尤其是近年来随着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，使得对蛋白质的分离检测技术有了更高的要求。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS-page)是目前蛋白质分离鉴定实验中较为常用的实验技术。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。凝胶由分离胶和浓缩胶组成，下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。上层为浓缩胶，具有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层，大大提高了分辨率。但是，该方法中，在凝胶电泳过程完成后，蛋白还需用氨基黑、考马斯亮蓝、银染色剂等进行染色，然后脱色处理后观察结果，一般染色时间为25min，而脱色时间更是长达12-24h之久，实验过程长而且复杂，所用染色剂还有一定的污染和危害性，限制了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质分析检测中的进一步应用。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种新的检测蛋白质的方法，该方法使用特定的荧光剂与蛋白结合形成复合物，无需经过传统的染色和脱色步骤，可以快速检测蛋白，而且检测时间短、检测成本低，并减少了对环境的污染。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测蛋白质的方法，包括如下步骤：(1)将蛋白质样品进行变性处理，然后向变性处理后的蛋白质样品中加入丹磺酰氯溶液，30-50℃下放置20-120min；(2)配制SDS-PAGE，加入步骤(1)处理后的蛋白质样品，进行凝胶电泳操作；(3)电泳完成后，将蛋白胶置于紫外灯或LED灯下观察，直接得出检测结果。优选的，步骤(1)中，蛋白质样品变性处理的方法为：将蛋白质样品在90-120℃下处理3-15min。优选的，步骤(1)中，所述丹磺酰氯溶液为丹磺酰氯与水配制的过饱和溶液或丹磺酰氯与有机溶剂配制的溶液；所述有机溶剂为丙酮、正丁醇、二氯甲烷、乙腈或苯中的任一种；进一步优选的，所述有机溶剂为丙酮或正丁醇。更为优选的，所述丹磺酰氯溶液为丹磺酰氯与水配制的过饱和溶液。优选的，所述丹磺酰氯溶液中，丹磺酰氯的浓度为0.0002-0.001g/ml；更为优选的，所述丹磺酰氯溶液中，丹磺酰氯的浓度为0.0003g/ml。优选的，步骤(1)中，丹磺酰氯溶液与蛋白质样品加入量的比为5ml：(5-30)mg。本专利技术在试验过程中发现，采用丹磺酰氯对蛋白质进行荧光标记处理，丹磺酰氯溶液的溶剂种类、丹磺酰氯溶液的浓度、丹磺酰氯溶液与蛋白质的配比、处理的温度和处理的时间等都会对荧光标记处理效果产生影响，是影响最终蛋白检测效果的关键因素。其中，对于配制丹磺酰氯溶液所采用的溶剂种类，由于溶剂的种类众多，包括有机溶剂和无机溶剂，根据丹磺酰氯溶解性的特点，本专利技术首先从有机溶剂中进行优化选择，不同种类的有机溶剂，一方面对丹磺酰氯的溶解效果存在差异；另一方面，溶解丹磺酰氯后对蛋白质荧光标记的处理效果也会有不同。经大量试验发现，以二氯甲烷、乙腈或苯等有机溶剂作为溶剂配制溶液，虽然有较好溶解效果，但不能同时具有较好的荧光标记处理效果，检测效果不稳定，且容易出现亮带；而以丙酮和正丁醇作为溶剂，具有很好的溶解效果，和较好的荧光标记处理效果，但是检测效果仍相对不太稳定。由于丹磺酰氯是水不溶的，本专利技术在试验前期曾将水排除在外，但后期意外的发现，将丹磺酰氯用水配制成过饱和溶液(或称之为“悬浊液”)，将其用于蛋白质的荧光标记处理，取得了意想不到的效果，电泳条带清晰，检测效果稳定，不再出现亮带的情况。因此，将丹磺酰氯用水配制成过饱和溶液，再对蛋白质进行荧光标记处理的效果最佳；而且以水作为溶剂安全、无毒，大大降低了试验的污染性和危害性。对于处理的温度，温度过低会使得丹磺酰氯不能对蛋白质进行充分标记，温度过高则会使标记破坏，因此，处理温度的选择十分关键，本专利技术发现，处理温度为30-50℃时，处理效果较佳；特别的，处理温度为37℃时，荧光标记处理效果最优。对于丹磺酰氯溶液与蛋白质样品加入量的比，若丹磺酰氯溶液加入量过少，会使得丹磺酰氯不能对蛋白质进行充分标记；丹磺酰氯溶液加入量过多，则会影响电泳检测效果。经试验优选发现，当丹磺酰氯溶液与蛋白质样品加入量的比为5ml：(5-30)mg时能够取得最优的蛋白检测效果。另外，利用丹磺酰氯溶液对蛋白质进行荧光标记的时机也很关键，本专利技术在试验过程中曾分别选择在蛋白变性前和凝胶电泳后再进行荧光标记，结果蛋白检测结果均不理想，在紫外灯或LED灯下观察，并无相应的条带出现。优选的，步骤(2)中，SDS-PAGE的配制包括：分离胶的配制和浓缩胶的配制。优选的，分离胶的配制方法为：按ddH2O1.3ml、丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29:1)1.65ml、1.5MTris-HCl(pH8.8)1.9ml、10％SDS0.05ml、10％AP0.05ml、TEMED0.05ml配料，混匀后将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内，在凝胶表面加一层水以隔绝空气，使胶面平整，待胶体凝固后倒掉上层的水。优选的，浓缩胶的配制方法为：按ddH2O1.3ml、丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29:1)0.3ml、0.5MTris-HCl(pH6.8)0.25ml、10％SDS0.06ml、10％AP0.06ml、TEMED0.04ml配料，混匀后将凝胶溶液注入分离胶上方，加入样品模板梳，静置，至胶体凝固。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术利用丹磺酰氯对蛋白质样品进行荧光标记处理，处理样品与SDS-PAGE的配制同步进行，电泳后无需再进行染色和脱色的步骤，与现行的检测方法相比，大大缩短了实验时长，减少了实验复杂度。(2)本专利技术中所使用的丹磺酰氯极其微量，因此相比现行的检测方法，其污染性和危害性要小很多，而且降低了检测的成本。附图说明图1：实施例1的蛋白检测结果；图中，泳道1:55kDa，泳道2:66kDa；泳道3：29kDa；泳道4：三本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将蛋白质样品进行变性处理，然后向变性处理后的蛋白质样品中加入丹磺酰氯溶液，30‑50℃下放置20‑120min；(2)配制SDS‑PAGE，加入步骤(1)处理后的蛋白质样品，进行凝胶电泳操作；(3)电泳完成后，将蛋白胶置于紫外灯或LED灯下观察，直接得出检测结果。

【技术特征摘要】
1.一种检测蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将蛋白质样品进行变性处理，然后向变性处理后的蛋白质样品中加入丹磺酰氯溶液，30-50℃下放置20-120min；(2)配制SDS-PAGE，加入步骤(1)处理后的蛋白质样品，进行凝胶电泳操作；(3)电泳完成后，将蛋白胶置于紫外灯或LED灯下观察，直接得出检测结果。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，蛋白质样品变性处理的方法为：将蛋白质样品在90-120℃下处理3-15min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述丹磺酰氯溶液为丹磺酰氯与水配制的过饱和溶液；或丹磺酰氯与有机溶剂配制的溶液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为丙酮、正丁醇、二氯甲烷、乙腈或苯中的任一种；优选的，所述有机溶剂为丙酮或正丁醇。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述丹磺酰氯溶液为丹磺酰氯与水配制的过饱和溶液。6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述丹磺酰氯溶液中，丹磺酰氯的浓度为0.0002-0.001g/ml，优选为0.000...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘奉鑫，张楠，穆相悦，程睿滢，方诩，
申请(专利权)人：荣成市慧海创达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37