碱性木糖葡聚糖酶制造技术

在ｐＨ７条件下的相对木糖葡聚糖酶活性至少为５０％、没有或者仅有微弱纤维素分解活性的木糖葡聚糖酶是可获得的，例如可从芽孢杆菌属的菌株中获得。含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２第３０—２６１位所示氨基酸序列的木糖葡聚糖酶或同系物可获自如地衣芽孢杆菌ＡＴＣＣ１４５８０，并且可由含ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１中从第８８—７８３位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子编码；含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４第１—５３７位所示氨基酸序列的木糖葡聚糖酶或同系物可获得自如Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ，ＮＣＩＭＢ４０４８２，并可由含ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３中第１—１６１１位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子编码。所述木糖葡聚糖酶可用于例如洗涤剂组合物中，并可用于纤维素纤维的处理中。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及碱性木糖葡聚糖酶(xyloglucanase)，即在中性和碱性pH范围内呈现木糖葡聚糖酶活性作为它们的主要酶活性的酶；涉及这些酶的制备方法；还涉及将这些酶用于纺织品、洗涤剂和纤维素纤维加工工业中的方法。
技术介绍
木糖葡聚糖是植物初生(正生长的)细胞壁中的一种主要结构多糖。从结构上讲，木糖葡聚糖由频繁被多种侧链取代的纤维素样β-1，4-键连接的葡萄糖骨架组成。多数双子叶植物、某些单子叶植物和裸子植物的木糖葡聚糖是高度分支多糖，其中骨架中约75％的葡萄糖残基在0-6位带有糖基侧链。直接与分支葡萄糖残基连接的糖基都是α-D-木糖。由于木糖残基在0-2位上有β-D-半乳糖或α-L-岩藻糖-(1-2)-β-D-半乳糖组成部分，因此木糖葡聚糖中高达50％的侧链包含1个以上的残基(C.Ohsumi和T.Hayashi(1994)植物和细胞生理学35963-967；G.J.McDougall和S.C.Fry(1994)植物生理学杂志143591-595；J.L.Acebes等人(1993)植物化学331343-1345)。在酸水解中，抽提自棉纤维的木糖葡聚糖以50∶29∶12∶7的比例产生葡萄糖、木糖、半乳糖和岩藻糖(Hayashi等人，1988)。茄科植物产生的木糖葡聚糖比较特殊，因为通常其中只有40％的β-1，4-键连接的葡萄糖残基在0-6上带糖基侧链。此外，高达60％的木糖残基在0-2位被α-L-阿拉伯糖基取代，一些茄科植物，诸如马铃薯之类，也有在一些木糖残基0-2位存在β-D-半乳糖取代基的木糖葡聚糖(York等人(1996))。木糖葡聚糖被认为通过交联纤维素微丝形成纤维素-木糖葡聚糖网而在植物初生壁中起作用。该网状结构被认为是初生细胞壁的结构完整性所必需的(Carpita等人，1993)。木糖葡聚糖的另一重要功能是作为木糖葡聚糖亚基寡糖的贮藏器，它是植物细胞生长的生理活性调节剂。木糖葡聚糖亚基也可调节木糖葡聚糖内切转糖苷酶(XET)的作用，XET是一种推测在植物细胞壁延伸中起作用的细胞壁相关酶。因此木糖葡聚糖可能在壁松弛及由此产生的细胞膨胀中起重要作用(Fry等人，1992)。许多双子叶植物的种子包含木糖葡聚糖作为主要的多糖贮藏后备。这种类型的木糖葡聚糖位于种子子叶细胞壁里面的巨大增厚部分中，它主要由葡萄糖、木糖和半乳糖组成(Rose等人，1996)。在1943年，当树胶被发现可用作纸和纺织品浆料时，罗望子树酸豆(Tama rindus indica)的种子就成为树胶的商业来源。由于树胶的低成本及其优秀特性，在亚洲已广泛使用罗望子树木糖葡聚糖来对黄麻和棉进行上浆。罗望子树木糖葡聚糖食品应用包括用于糖果、果酱和果子冻中，并可做为冰淇琳和蛋黄酱中的稳定剂(Whistler等，1993)。木糖葡聚糖酶活性不包括在由酶命名法提供的酶分类中(1992)。迄今为止，这一酶活性只被简单归于葡聚糖酶活性类，并常被认为与纤维素分解活性(EC 3.2.1.4)，即水解纤维素或纤维素衍生底物中β-1，4-糖苷键的活性相同，或至少是具纤维素分解活性的酶的一种次要活性。然而，真正的木糖葡聚糖酶是真正具木糖葡聚糖专一性的酶，它能催化木糖葡聚糖至木糖葡聚糖寡糖的水解作用，但无实质的纤维素分解活性，例如，水解常规使用的纤维素样底物CMC(羧甲基纤维素)、HE纤维素和Avicel(微晶纤维素)的活性。木糖葡聚糖酶裂解木糖葡聚糖骨架中的β-1，4-糖苷键。Vincken等人描述了木糖葡聚糖酶活性(1997)，他从绿色木霉(与T.reesei相似)中鉴定出了三种不同内切葡聚糖酶，这三种酶都具有水解纤维素或CMC的高活性，并显示出EndoI(真正属于糖基水解酶家族5，参阅Henrissat，B.等人(1991，1993))基本上无(即很少有)水解木糖葡聚糖的活性，而EndoV(属于糖基水解酶家族7)和EndoIV(属于糖基水解酶家族12)均分别具有水解木糖葡聚糖和CMC的活性，并且活性水平相当。国际专利申请文件WO 97/13862描述了两种来自EP-A 0 463 706所述黑曲霉N400的纤维素酶。通过与EMBL数据库中已知的同源纤维素酶比较，lac12序列归于家族12，而lac64的序列被测定属于家族5。这两种酶均具有纤维素酶和β-葡聚糖酶活性。它们对大麦β-葡聚糖具有最高活性，且它们均显示了良好的CMC活性和一些木糖葡聚糖酶活性。两种酶对CMC的最适pH为pH3.5，对大麦β-葡聚糖为pH5.5。国际专利申请文件WO 94/14953公开了克隆自棘孢曲霉并表达于米曲霉中、具高木糖葡聚糖酶活性和很低的纤维素酶活性的木糖葡聚糖酶(EGII)。该EGII酶在pH2.5-6的范围内显示有木糖葡聚糖酶活性，最佳活性在pH3-4，它也属于糖基水解酶的家族12。总之，直到目前为止，只在属于糖基水解酶家族7和12的真菌酶中发现有木糖葡聚糖酶活性，这些酶在酸性至近中性pH范围内展现该活性。然而，许多重要的工艺，或者工业工艺或者使用工业生产试剂的工艺，是在碱性pH条件下操作的。因此，本专利技术的一个目的是提供在碱性pH时有高木糖葡聚糖酶活性，并对纤维素或纤维素衍生物基本无活性的真正木糖葡聚糖酶。专利技术概述专利技术者现已发现了在碱性范围内具有高木糖葡聚糖酶活性的酶，这些酶没有或只有很小的纤维素分解活性。因此，本专利技术涉及含有木糖葡聚糖酶的酶制剂，该木糖葡聚糖酶在pH≥7的条件下具有至少50％的相对木糖葡聚糖酶活性，并优选对纤维素或纤维素衍生底物很小或无活性，如具有的最大木糖葡聚糖酶活性与对CMC或Avicel的最大活性比率至少为2∶1。专利技术者还成功地克隆和表达了木糖葡聚糖酶，即本专利技术在进一步的方面涉及木糖葡聚糖酶，该酶是(a)由Bacillus agardhaerens，NCIMB 40482产生的多肽，或(b)含SEQ ID NO4中第1-537位所示氨基酸序列的多肽，或(c)(a)或(b)所限定多肽的类似物，它们与所述多肽至少有70％同源性，或是通过一个或多个氨基酸的取代、删除或添加而衍生自所述多肽，或与针对纯化形式的该多肽产生的多克隆抗体具免疫反应性；另一方面涉及的木糖葡聚糖酶是(a)地衣芽孢杆菌，ATCC 14580产生的多肽，或(b)含SEQ ID NO2中第30-261位所示氨基酸序列的多肽，或(c)(a)或(b)中所限定多肽的类似物，它们与所述多肽至少具70％的同源性，或是通过一个或多个氨基酸的取代、删除或添加而衍生自所述多肽，或与针对纯化形式的该多肽产生的多克隆抗体具免疫反应性；另一方面涉及编码具木糖葡聚糖酶活性的多肽的分离多核苷酸分子，它们选自(a)含SEQ ID NO1中第88-783位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)编码的多肽与SEQ ID NO2中第30-261位氨基酸残基序列至少具70％相同的多核苷酸分子；和(c)(a)或(b)的简并核苷酸序列；本专利技术又涉及编码具木糖葡聚糖酶活性的多肽的分离多核苷酸分子，它们选自下组(a)含SEQ ID NO3中第1-1611位核苷酸所示核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)编码与SEQID NO4第1-537位氨基酸残基的氨基酸序列至少70％相同的多肽的多核苷酸分子；及(c)本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含ｐＨ７时具至少５０％相对木糖葡聚糖酶活性的木糖葡聚糖酶的酶制剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M舒兰，H奥特鲁普，PL卓根森，ME卓恩瓦德，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]