内切-β-1,4-葡聚糖酶制造技术

具有内切－β－１，４－葡聚糖酶活性（ＥＣ　３．２．１．４）的酶在去污剂和纺织应用中的用途，所述酶选自以下之一：ａ）由ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１中第１到２３２２位ＤＮＡ序列编码的多肽；ｂ）通过培养包含ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１序列的细胞而产生的多肽，所述培养在该ＤＮＡ序列得以表达的条件下进行；ｃ）具有如下序列的内切－β－１，４－葡聚糖酶，该序列与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２第１到７７３位氨基酸序列和其具有内切－β－１，４－葡聚糖酶活性的片段有至少９７％同一性；和ｄ）具有内切－β－１，４－葡聚糖酶活性的多肽，所述多肽由与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１第１到２３２２位中所示核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,4－葡聚糖酶的制作方法
本专利技术涉及为芽孢杆菌属种DSM 12648菌株的内源酶的具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶，涉及编码该内切-β-1，4-葡聚糖酶的分离多核苷酸分子，以及涉及该酶在去污剂、纸和纸浆、石油钻探、油的提取、酒和果汁、食物成分、动物饲料或纺织工业中的应用。
技术介绍
纤维素为通过β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖多聚体。纤维素链形成众多分子内和分子间氢键，这导致形成不溶性的纤维素微丝。微生物将纤维素水解为葡萄糖涉及以下三类主要的纤维素酶(i)在纤维素分子中随机切割β-1，4-糖苷键的内切-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)，也称作内切-β-1，4-葡聚糖酶；(ii)从非还原末端消化纤维素而释放纤维二糖的纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；以及(iii)水解纤维二糖和低分子量纤维糊精以释放葡萄糖的β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。β-1，4-糖苷键也存在于其他天然多聚体内，例如存在于来自如大麦和燕麦等植物的β-葡聚糖中。在一些情况下，内切葡聚糖酶也可以水解此类非-纤维素多聚体。纤维素酶由多种微生物产生且经常以多种形式存在。对酶促降解纤维素的经济学重要性的认识已推动了可工业应用的微生物纤维素酶的广泛研究。结果是，已对大量纤维素酶的酶学特性和一级结构进行了研究。根据对催化结构域氨基酸序列的疏水簇的分析结果，这些纤维素酶已被归入不同的糖基水解酶家族；真菌和细菌糖基水解酶已被划分成35个家族(Henrissat，B.基于氨基酸序列相似性对糖基水解酶的分类，生物化学杂志(Biochem.J.)280(1991)，309-316；Henrissat，B.，和Bairoch，A.基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类中的新家族，生物化学杂志(Biochem.J).293(1993)，781-788.)。大多数纤维素酶由纤维素结合结构域(CBD)和催化结构域(CAD)组成，二者由可富含脯氨酸和羟基氨基酸残基的连接物分开。已经基于CBD的类似性建立了纤维素酶的另一分类方法(Gilkes等.(1991))，此方法将糖基水解酶分成5个家族。纤维素酶可以由多种微生物合成，包括真菌、放线菌、粘细菌和真细菌，也可以由植物合成。特别是已鉴定出具有各种专一性的内切-β-1，4-葡聚糖酶。许多细菌内切葡聚糖酶已有描述(Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)139187-194；Henrissat，B.，和Bairoch，A.基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类中的新家族，生物化学杂志(Biochem.J.)293(1993)，781-788.)。纤维素水解酶的一个重要工业应用是用于处理纸浆，如用于改善滤水或用于再生纸的脱墨。纤维素水解酶的另一重要工业应用是用于处理纤维素纺织品或织物，如用作去污剂组合物或织物柔软组合物中的组分，用于新织物的生物抛光(衣件后处理)，以及用于获得含纤维素织物(特别是粗斜纹棉布)的“石洗”外观，且已提出了用于此类处理的几种方法，例如，在GB-A-1 368 599、EP-A-0 307 564、EP-A-0 435 876、WO 91/17243、WO 91/10732、WO 91/17244、WO 95/24471和WO 95/26398中。JP专利申请号13049/1999公开了一种适用于去污剂的来自芽孢杆菌属种KSM-S237(保藏号FERM P-16067)的耐热碱性纤维素酶。但仍持续需要提供新的纤维素酶或者酶制品以用于需要纤维素酶，优选地内切-β-1，4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的应用中。本专利技术的目的为提供新的酶和酶组合物，所述酶和酶组合物在微酸到碱性环境中具有实质上的β-1，4-葡聚糖酶活性，并在纸浆加工、织物处理、洗衣过程、提取过程或在动物饲料中具有改进的性能；优选地此新的性能优良的葡聚糖酶通过(或可以通过)应用重组技术以高产量产生。专利技术概述本专利技术人发现了具有实质上内切-β-1，4葡聚糖酶活性(根据酶命名法分类为EC 3.2.1.4)的新酶，该酶为芽孢杆菌属种AA349(DSM 12648)菌株的内源酶；此外本专利技术人已成功克隆和表达了编码该酶的DNA序列。本专利技术的内切β-1，4-葡聚糖酶所具有的稳定性和活性特征使其特别适用于涉及含表面活性剂和/或漂白剂的碱性水溶液的应用中。该应用条件非常普遍，既存在于家庭和工业去污剂及织物整理中亦存在于纤维素纸浆的生产或再循环中。由于本专利技术的β-1，4-葡聚糖酶可以在此相关应用条件下异常高程度地维持其活性，因此认为当例如用于去污剂、用于纸/纸浆加工或用于织物处理时它将较其它已知的酶更为有用。此外应指出的是，本专利技术的β-1，4-葡聚糖酶不会被Fe(II)离子显著失活。酶活性对铁离子存在的敏感性可限制酶的应用，所述应用如在金属容器中实施的方法。因此，本专利技术的第一方面涉及具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)的酶，所述酶选自以下之一(a)SEQ ID NO1中全部或部分DNA序列编码的多肽；(b)通过培养包含SEQ ID NO1序列的细胞而产生的多肽，所述培养在该DNA序列得以表达的条件下进行；(c)具有如下序列的内切-β-1，4-葡聚糖酶，当通过GCG程序包中提供的GAP测定同一性时(使用的GAP创建罚分(creation penalty)为3.0且GAP延伸罚分(extensionpenalty)为0.1)，该序列与(I)SEQ ID NO2中1-773位或其具有内切-葡聚糖酶活性的片段、(II)SEQ ID NO2中1到约340位氨基酸序列和(III)SEQ ID NO2中从1位到约540和773位之间的氨基酸序列有至少97％、优选地98％、更优选地98.5％、甚至更优选地99％的同一性；和(d)具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的多肽，其中编码该多肽的多核苷酸可以与SEQ ID NO1第1-2322位中所示核苷酸序列杂交，杂交条件包括45℃时5×SSC，洗涤条件包括60℃时2×SSC。在一优选实施方案中所述片段为由1到663±50位氨基酸、优选地由1到663±25位氨基酸组成的多肽。本专利技术的第二方面涉及分离的多核苷酸分子，优选地DNA分子，所述分子编码具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的酶的催化活性结构域，该分子选自(a)包含SEQ ID NO1第1到2322位核苷酸中所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的物种同系物；(c)编码如下多肽的多核苷酸分子，所述多肽与SEQ ID NO2第1到773位氨基酸残基的氨基酸序列的同一性为至少97％、优选地为98％、更优选地为98.5％、甚至更优选地为99％；和(d)(a)或(b)的简并核苷酸序列；优选能够与变性双链DNA探针在严紧的介质条件下进行杂交的多核苷酸分子，其中所述探针选自包含SEQ IDNO1中1-2322位所示序列的DNA探针以及包含SEQ ID NO1的1-2322位中长度至少约100个碱基对的亚序列的DNA探针。本专利技术的第三、第四和第五方面提供了包含DNA片段(例如，本专利技术的多核苷酸分子)的表达载体；包含该DNA片段或该表达载体的细胞；以及生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有内切－β－１，４－葡聚糖酶活性（ＥＣ３．２．１．４）的酶，所述酶选自下列之一：　　　　（ａ）ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的第１到２３２２位ＤＮＡ序列编码的多肽；　　　　ｂ）通过将包含ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１序列的细胞在该ＤＮＡ序列可以得以表达的条件下培养而产生的多肽；　　　　ｃ）具有如下序列的内切－β－１，４－葡聚糖酶，所述序列与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：２第１到７７３位氨基酸序列或其具有内切－β－１，４－葡聚糖酶活性的片段有至少９７％的序列同一性，其中所述同一性通过ＧＣＧ程序包中提供的ＧＡＰ进行测定，应用的ＧＡＰ创建罚分为３．０且ＧＡＰ延伸罚分为０．１。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：H乌特鲁普，M许莱因，MB埃斯凯林德，K吉布森，
申请(专利权)人：诺和酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]