本发明专利技术涉及属于ＣＢＭ新家族的非催化性碳水化合物结合组件（ＣＢＭ）。发现本发明专利技术的ＣＢＭ附着于糖基水解酶家族６１（ＧＨ６１）多肽并显示与已知的ＣＢＭ几乎没有同源性，这表示它是ＣＢＭ新家族的第一个已知成员。本发明专利技术还涉及优选对纤维素显示出亲和力的ＣＢＭ；产生该ＣＢＭ的方法；以及在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维生产工业中、纯化多肽、活性酶固定、焙烤、制造生物燃料、改变植物细胞壁中使用该ＣＢＭ的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及属于CBM新家族的非催化性碳水化合物结合组件(CBM)。发现本专利技术的CBM附着于糖基水解酶家族61(GH61)多肽并显示与已知的CBM几乎没有同源性，这表示它是CBM新家族的第一个已知成员。本专利技术还涉及优选对纤维素显示出亲和力的CBM；产生该CBM的方法；以及在纺织品、洗涤剂和纤维素纤维生产工业中、纯化多肽、活性酶固定、焙烤、制造生物燃料、改变植物细胞壁中使用该CBM的方法。
技术介绍
碳水化合物结合组件(CBM)被定义为带有具碳水化合物结合活性的不连续折叠的碳水化合物活性酶中的连续氨基酸序列。CBM在较大的酶中作为组件存在的需要将该类碳水化合物结合蛋白质与其他非催化性糖结合蛋白质(如凝集素和糖转运蛋白)区别开来。根据一些结合纤维素组件的最初发现(Tomme等(1989)FEBS Lett.243，239-243；Gilkes等(1988)J.Biol.Chem.263，10401-10407)，CBM曾经被归类为纤维素结合结构域(CBD)。然而，持续发现碳水化合物活性酶中结合非纤维素外的碳水化合物并符合CBM标准的组件。之前对纤维素结合结构域的归类基于氨基酸相似性。CBD分组被称为“型”并以罗马数字编号(例如I型或II型CBD)。为了与糖苷水解酶分类一致，现在将这些分组称为家族并用阿拉伯数字编号。家族1到13与I到XIII型相同(Tomme等(1995)in Enzymatic Degradation of InsolublePolysaccharides(Saddler & Penner编)142-163，American ChemicalSociety，Washington)。最近，已知的CBM被分类在家族1-6和8-33中。大部分分类的CBM是细菌来源的，且已知的真菌碳水化合物结合组件主要被归类于CBM1家族。然而，在CBM13、CBM18、CBM19、CBM20和CBM24中也发现典型的真菌CBM。迄今为止，只有来自CBM1的真菌碳水化合物结合组件已知与微晶纤维素结合。来自CBM13、CBM18、CBM19、CBM20和CBM24家族的真菌CBM已经显示与底物例如壳多糖、淀粉和齿斑葡聚糖结合。然而，来自CBM1的真菌碳水化合物结合组件也与壳多糖很好的结合。大量真菌纤维素酶已经显示含有CBM1家族的由36个氨基酸残基组成的CBD。已知含有该结构域的酶实例为来自瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的内切葡聚糖酶I(基因egl1)，来自瑞氏木霉的内切葡聚糖酶II(基因egl2)，来自瑞氏木霉的内切葡聚糖酶V(基因egl5)，来自灰腐质酶(Humicola grisea)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、瑞氏木霉和绿色木霉(Trichoderma viride)的外切纤维二糖水解酶I(基因CBHI)，来自瑞氏木霉的外切纤维二糖水解酶II(基因CBHII)，来自二孢蘑菇(Agaricus bisporus)的外切纤维二糖水解酶3(基因cel3)，来自尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)的内切葡聚糖酶B、C2、F和K，在这些酶的N端(Cbh-II或egl2)或C端末端(Cbh-I、egl1或egl5)均发现CBD结构域。在该类型CBD结构域中有四个保守的半胱氨酸残基，它们均与二硫键有关(Prosite，Swiss Institute of Bioinformatics)。可使用PCR技术并根据现有知识常规获得来自给定生物的编码CBD的DNA序列；可能从其他生物找到同源序列。设想通过克隆纤维素酶、木聚糖酶或其他植物细胞壁降解酶并测量与(例如)纤维素的结合来发现新的CBD。如果酶在下文描述的标准条件下结合Avicel，可假设基因的部分编码结合结构域。可从植物获得的CBM样多肽的实例为扩展蛋白。扩展蛋白本质上不是CBM，因为未发现它们由具有酶活性的同样的氨基酸序列编码。然而，观察到分离的CBM结构域可具有对纤维素的扩展蛋白样活性(Levy和Shoseyov，2002，见上文)。Din等(Bio/Technology 9(1991)1096-1099)报道来自粪肥纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)内切葡聚糖酶A的CBDCenA能够非水解性破坏引起小颗粒释放的纤维素纤维活性。另外，显示CBD CenA能够阻止微晶细菌纤维素的絮凝(Gilkes等(1993)Int.J.Biol.Macromol.15347-351)。在其他CBD中观察到类似的现象(Krull等(1988)Biotechnol.Bioeng.31321-327；Banka等(1998)World J.Microbiol.Biotechnol.14551-558；Gao等(2001)Acta Biochim.Biophys.Sin.3313-18)。已知使用CBM广泛应用于洗涤、纺织品处理、牙菌斑去除、多肽纯化、活性酶固定、纤维质材料修饰、焙烤、生物燃料制造、植物细胞壁修饰。专利技术概述本专利技术者目前发现可从真菌假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)(保藏号CBS 444.97)中获得的具有纤维素亲和力的碳水化合物结合组件(CBM)，发现新的CBM与属于糖基水解酶家族61(GH61)的酶结合。新的CBM(称为CBMX)显示对Avicel具有亲和力并与已知的CBM不具有可见的同源性(小于20％)。并且，本专利技术CBM中发现没有一个半胱氨酸残基位置与上述CBM1家族中很保守的半胱氨酸残基位置对应。这指示本专利技术的CBM为CBM新家族的第一个已知成员。除具有纤维素亲和力的CBM1家族的真菌CBM外，本专利技术CBM为第一个显示具有纤维素亲和力的已知真菌CBM。本专利技术者成功克隆并表达了与GH61酶家族结合的CBM。此外，专利技术者表达了不带有GH61酶的结构域并证明CBM可独自结合纤维素(例如Avicel)。所述CBM结构域由SEQ ID NO1的109-531位置DNA序列编码并具有SEQ ID NO2的34-174位置氨基酸序列。SEQ ID NO2的位置1-33组成了GH61酶的信号肽和N端区域。因此，本专利技术涉及新CBM家族的CBM，其中CBM为 (a)SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列或与SEQ ID NO1同源的DNA序列编码的多肽，所述同源DNA序列与SEQ ID NO1位置109-531有至少40％同一性，优选至少50％同一性，更优选至少60％同一性，更优选至少70％同一性，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％同一性，更优选至少97％同一性，更优选至少98％同一性，特别优选与SEQ ID NO1位置109-531有至少99％的同一性；(b)通过在DNA序列表达的条件下培养包含SEQ ID NO1位置109-531的DNA序列的细胞所产生的多肽；(c)具有SEQ ID NO2位置34-174氨基酸序列的多肽，或与SEQID NO2同源的多肽，其中多肽与SEQ ID NO2位置34-174有至少40％同一性，优选至本文档来自技高网...
【技术保护点】
碳水化合物结合组件，其为 （ａ）由ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１位置１０９－５３１的ＤＮＡ序列或与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１位置１０９－５３１有至少５０％同一性的与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１同源的ＤＮＡ序列编码的多肽，或 （ｂ）通过在表达ＤＮＡ序列的条件下培养包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１位置１０９－５３１的ＤＮＡ序列的细胞产生的多肽，或 （ｃ）具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２位置３４－１７４氨基酸序列的多肽，或与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２同源且与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２位置３４－１７４有至少５０％同一性的多肽，或 （ｄ）由在低严格条件下与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１位置１０９－５３１ＤＮＡ序列杂交的ＤＮＡ序列编码的多肽，或 （ｅ）分离的多核苷酸分子编码的多肽，该多核苷酸分子与变性的双链ＤＮＡ探针在低严格条件下杂交，其中探针选自包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１位置１０９－５３１所示序列的ＤＮＡ探针，以及包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１位置１０９－５３１的子序列的ＤＮＡ探针，该子序列有至少大约３００碱基对的长度。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：KM施诺尔，LLH克里斯坦森，
申请(专利权)人：诺和酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]
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