使用酪氨酸激酶SRC调制血管生成的方法和组合物技术

本发明专利技术描述了使用Ｓｒｃ蛋白质、修饰的Ｓｒｃ蛋白质和编码这类蛋白质的核酸在组织中调制血管生成的方法。本发明专利技术特别描述了用于使用失活的Ｓｒｃ蛋白质或编码它们的核酸抑制血管生成或用于使用活性Ｓｒｃ蛋白质或编码它们的核酸强化血管生成的方法。本发明专利技术还描述了基因转运系统用于提供编码Ｓｒｃ蛋白质或其修饰形式的核酸的用途。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的参考本申请要求1998年5月29日提交的美国临时申请顺序号60/087,220的利益，正如本文所引用的所有参考文献一样，将该文献引入作为参考。背景血管生成是一种包括新发育的血管生长成组织的组织血管化的过程并且还将它称作新血管形成。该过程由内皮细胞和平滑肌细胞渗入介导。认为该过程以下列三种方式中任意一种进行血管从预先存在的血管中生长；血管的从新发育可能是由前体细胞导致的(血管发生)；或存在的小血管可以直径扩大。参见Blood等《生物化学和生物物理学誌》(Bioch.Biophys.Acta)1032,89-118(1990)。血管生成是新生儿生长中的重要过程，而在伤口愈合过程中和大量不同的临床疾病的发病机制中也是重要的，所述的临床疾病包括组织炎症、关节炎、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病、由视网膜新血管形成导致的黄斑变性和类似疾病。将这些与血管生成有关的临床表现称作血管源性疾病。参见Folkman等《科学》(Science),235:442-447(1987)。一般在成年人或成熟组织中不存在血管生成，不过它确实在伤口愈合过程中和黄体生长周期中发生。参见例如Moses等《科学》(Science),248:1408-1410(1990)。已经提出抑制血管生成是用于限制肿瘤生长的有用的疗法。已经提出通过下列方法来抑制血管生成(1)抑制“血管源性分子”诸如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的释放；(2)诸如通过使用抗βbFGF抗体使血管源性分子失效；(3)应用玻连蛋白受体αvβ3的抑制剂；和(4)抑制内皮细胞对血管源性刺激物的反应。这后一种策略已经受到关注，且Folkman等在《癌症生物学》(Cancer Biology)，3:89-96(1992)中已经描述了几种内皮细胞反应抑制剂，包括可用于抑制血管生成的胶原酶抑制剂、基膜更新抑制剂、静态血管类固醇、真菌产生的血管生成抑制剂、血小板因子4、血小板生成素、诸如D-青霉胺和硫羟苹果酸金这样的关节炎药物、维生素D3类似物、α-干扰素等。对于另外提示的血管生成抑制剂来说，参见Blood等《生物化学和生物物理学誌》(Bioch.Biophys.Acta)1032,89-118(1990)；Moses等《科学》(Science),248:1408-1410(1990)；Ingber等《实验室研究》(Lab.Invest.)59:44-51(1988)；和美国专利5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352、5,753,230和5,766,591。在上述参考文献中所述的血管生成抑制剂中没有一种包括Src蛋白质。为使血管生成发生，内皮细胞必须首先以肿瘤细胞发生侵害和转移瘤形成过程中所用的类似方式降解并通过血管基膜。目前已经有报导血管生成取决于血管整联蛋白与胞外基质蛋白之间的相互作用。参见Brook等《科学》(Science),264:569-571(1994)。此外，据报导血管源性血管细胞的程序性细胞死亡(编程性细胞死亡)由这种相互作用引发，所述的相互作用由血管整联蛋白αvβ3的某些拮抗剂来抑制。参见Brook等《细胞》(Cell),79:1157-1164(1994)。更进一步来说，已经报导使用αvβ5拮抗剂可以抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与玻连蛋白受体(αvβ5)的结合，且由此可抑制所述蛋白酶的酶功能。参见Brook等《细胞》(Cell),85:683-693(1996)。专利技术概括本专利技术涉及用酪氨酸激酶Src、本文一般也称作Src，在组织中调制血管生成的方法。本专利技术关注的是用于在组织中调制与疾病相关的血管生成的组合物和方法。将含有调制血管生成量的Src蛋白质的组合物给予所治疗的对调制血管生成有反应的疾病组织。提供Src蛋白质的该组合物可以含有纯化的蛋白质、蛋白质的生物活性片段、重组生产的Src蛋白质或蛋白质片段或其融合蛋白或用于表达Src蛋白质的基因/核酸表达载体。如果Src蛋白质失活或受到抑制，那么调制过程就是抑制血管生成。如果Src蛋白质是活性的或被激活，那么调制过程就是强化血管生成。所治疗的组织可以是需要调制血管生成的任意组织。对于血管生成抑制来说，将它用于治疗发生有害的新血管形成的患病组织。例示的组织包括炎症组织、实体肿瘤、转移瘤、发生再狭窄的组织及类似组织。对于强化来说，其用于治疗具有局部缺血肢体的患者，其中因糖尿病或其它疾病使肢体中存在不良循环。同样可以治疗带有不愈合且由此得益于血管细胞增殖增加和新血管形成的慢性伤口的患者。特别优选的是含有本文所述的修饰的氨基酸序列的Src蛋白质的应用。本文描述了几种特别有用修饰的Src蛋白质及其表达。本专利技术还包括一种用于刺激靶哺乳动物组织中血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的病毒或非病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码src蛋白质的核酸片段，所述的src蛋白质在527位密码子上带有除酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸外的任意氨基酸残基。另外关注的是一种用于抑制靶哺乳动物组织中血管生成的药物组合物，它包括含有核酸的病毒或非病毒基因转移载体和药物上可接受的载体或赋形剂；所述的核酸具有编码不具有激酶活性的src蛋白质的核酸片段。附图2是附附图说明图1中所示编码序列编码的鸡c-Src的氨基酸残基序列。附图3是首先由Braeuninger等在《美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),88:10411-10415(1991)中所述的人c-Src的cDNA序列。该序列可以通过基因库登记号X59932X71157找到。该序列含有蛋白质编码部分分别在相应的134和1486位核苷酸处开始和终止的2187个核苷酸。附图4是附图3中所示编码序列的编码的人c-Src的氨基酸残基序列。附图5解释了如实施例4中所述由bFGF或VEGF激活内源性Src的情况。附图上部表示使用由bFGF或VEGF倍增激活内源性c-Src的体外激酶试验结果。附图的下部是用抗-Src抗体作为等含量Src和IgG上样对照品探测的激酶试验印迹。附图6解释了如实施例4中所述的逆转录病毒介导的c-SrcA的基因表达对鸡尿囊绒膜(CAM)中血管生成的作用。使9日龄鸡CAMs与RCAS-SrcA(活性突变的c-Src)或对照品RCAS-GFP(绿色荧光蛋白；一种荧光指示剂蛋白)逆转录病毒或缓冲液接触72小时。如附图6A中所示，使用相应于用立体显微镜记录的各次处理结果的附图6B中有代表性的显微照片(4x)来对血管生成水平进行定量。附图7解释了c-SrcA在激活血管MAP激酶磷酸化中的逆转录病毒表达。附图7A表示已经与VEGF或PMA接触30分钟或用c-SrcA逆转录病毒感染48小时的10日龄鸡CAMs的组织提取物。NT代表没有经过处理。Src免疫沉淀自等量的总蛋白质提取物并使用FAK-GST融合蛋白作为底物进行了体外免疫复合激酶试验、将其进行电泳并转到硝化纤维上。还通过使用抗-磷酸-ERK抗体进行的免疫印迹测定了等份的上述完整组织裂解物的内源性ERK磷酸化作用。附图7B表示用模拟物RCAS或含有SRCA的RCAS感染的10日龄CAMs。两天后，解剖CAMs、将其在OCT中低温储藏并本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括包装物质和所述包装物质中含有的药物组合物的制品，其中所述的药物组合物能够在组织中调制与疾病状况相关的血管生成；其中所述的包装物质带有一种可指示将所述的药物组合物通过调制血管生成用于治疗疾病的标记；且其中所述的药物组合物含有Ｓｒｃ蛋白质或具有能够表达所述蛋白质的核苷酸序列的寡核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DA彻雷斯，B埃利赛里，PL施瓦茨博格，
申请(专利权)人：斯克里普斯研究学院，美国政府，
类型：发明
国别省市：US[美国]