减数分裂活化甾醇增大着床率制造技术

本发明专利技术涉及一种改善所获得的与体外受精和前成胚移植处理有关的卵母细胞和前成胚的生存力和怀孕潜力的新原理的用途。更明确地，通过提高在其中发生体外受精的培养基中减数分裂活化甾醇（ＭＡＳ）的含量来改善。这通过将一个或多个卵母细胞与精子一起暴露和培养于一种包括至少一种减数分裂活化甾醇（ＭＡＳ），一种ＭＡＳ类似物，和／或能够内源性刺激至少一种ＭＡＳ累积的添加剂或多种添加剂的培养基中而实现。优选的添加剂是ＦＳＨ和ＥＧＦ。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种改善所获得的与体外受精和前成胚转移处理有关的卵母细胞和前成胚的生存力和怀孕潜力的新原理的用途。更明确地，本申请涉及通过提高在其中至少发生体外受精的培养基中的，并且也优选地在其中在体外受精之前培养卵母细胞的培养基中的，减数分裂活化甾醇的含量改善卵母细胞和前成胚的妊娠潜力。
技术介绍
寻求不育治疗的夫妇，几乎没有例外地，将接受体外受精，其中发生卵母细胞和精子之间的体外会合。妇女通常正在接受用外生的激素治疗，从而调节和促进卵巢形成多于在自然月经周期期间见到的通常一个排卵前卵泡。本治疗的一部分包括从卵巢的排卵前卵泡中回收卵母细胞从而使卵母细胞成熟和/或体外受精。在体外受精和前成胚发育之后，将1到3个前成胚放置到妇女的子宫，她因此有怀孕和生育自己的孩子的可能。这现在是一项公认的治疗，它已经大规模进行了超过20年。虽然实现怀孕的可能性这些年来已经增加了，但是回收的卵母细胞经历受精和前成胚发育的频率已经保持显著恒定，大约是60-70％。然而，被置换的前成胚仅有大约15-25％着床并发育成后代。因此，回收的卵母细胞仅有一部份产生孕体。虽然为什么体外发育的前成胚只有这样小的一部份拥有着床能力的原因在很大程度上还不知道，但是已经提出了数种解释(Salha等，1998)卵泡/卵母细胞缺乏足够的成熟；卵泡/卵母细胞已经被暴露于最适度以下浓度的促性腺激素；卵母细胞的培养条件可能没有反映雌性生殖道内腔液的条件；卵母细胞遭受最适度以下的培养条件。在其天然的环境下，在第一次位于输卵管期间在包围着卵母细胞的卵泡液的海洋中的卵母细胞被从卵泡中排出。卵泡液与来自输卵管的分泌物混合，确定了在其中发生受精的环境。卵泡液含有许多据信是增加卵母细胞细胞核和卵母细胞细胞质成熟的物质。最近的报告显示特别是促卵泡激素(FSH)和表皮生长因子(EGF)参与了这些成熟过程。他们都存在于卵泡液，并且输卵管特别在排卵周围合成EGF(Morishige等，1993)。哺乳动物卵母细胞在以存在核膜，和/或胚泡(GV)为特征的第一次减数分裂的前期内被停滞。当卵母细胞恢复减数分裂时，利用胚泡崩解(GVBD)，又称为卵母细胞成熟，使其被显示。在卵泡中，因为在卵泡液中存在的次黄嘌呤(HX)和其它嘌呤的抑制成熟的作用，卵母细胞停留在GV期。当在存在生理浓度的次黄嘌呤的条件下培养时，培养中卵母细胞也保持在GV期，如果HX被除去，则恢复减数分裂。HX对于在培养的小鼠丘包封的卵母细胞(cumulus enclosed oocytes)，以及失去丘的裸露卵母细胞中减数分裂恢复的抑制作用，可以通过加入减数分裂活化甾醇(meiosis activating sterols)克服，例如FF-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇)或T-MAS(4，4-二甲基-5α-胆甾-8，24-二烯-3β-醇)。从人的卵泡液分离和鉴定FF-MAS，并从牛睾丸分离和鉴定T-MAS(Byskov等，1995)。这些甾醇是胆固醇生物合成途径中的中间体，并且是羊毛甾醇的直接产物(Schroepfer等，1972)(附图说明图1)。由CYP51基因编码的细胞色素P450羊毛甾醇14α-脱甲基酶(P45014DM)催化从羊毛甾醇合成FF-MAS。FF-MAS被甾醇14-还原酶(Δ14R)的活性转变为T-MAS。药物AY9944-A-7(AY)，选择性地抑制Δ14R的活性，它在二十世纪五十年代被用来降低血浆胆固醇。AY的化学结构与甾醇和胆固醇生物合成中的中间体完全无关(见综述Mercer，1993)。几项研究已经显示，当在存在AY的条件下培养时，产生胆固醇的细胞，累积4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇(也就是说，FF-MAS)。已经显示，AY(0.1μM)在培养的大鼠肝细胞中起一种Δ14R竞争性抑制剂的作用。已经显示，在体外生理浓度的FSH在小鼠中促进卵母细胞成熟，还在人和猴卵母细胞的胚泡期内的卵母细胞中促进卵母细胞成熟(Schramm和Bavister 1995)。已经显示，FSH刺激丘细胞合成正促进成熟的物质(Byskov等，1997)。然而，最近的一项研究显示，FSH降低在存在FSH的条件下生长的一组前成胚的三倍性比率，提示FSH在减数分裂最后阶段的一个特异性作用(Merriman等，1998)。进一步地，通过将这些前成胚放置到假孕的小鼠中，已经显示，在卵母细胞成熟培养基中存在FSH的组中，较之于对照培养基，着床(implantation)的数量提高了，并且几乎相似于体内成熟的卵母细胞的着床数量。已经表明，EGF在许多物种中增加卵母细胞成熟，例如牛、猪、小鼠和大鼠，并且，一项研究发现FSH似乎上调了大鼠粒层细胞中EGF受体的表达(Maruo等，1993)。EGF促进小鼠二细胞发育成胚泡(Morishige等，1993)。在人的卵母细胞中结果较不清楚。6小时的EGF浓度为1和10ng/ml的暴露没有反映在从IVF程序获得的卵母细胞的受精率增加中(Gomez等，1993)，尽管Goud等(1998)发现EGF(2ng/ml)增加培养30小时后达到中期II(MII)的胚泡卵母细胞的数量，并得出结论EGF改善体外人类卵母细胞的细胞核和细胞质成熟。在此即定的处理期间，体外受精在基础培养基中进行(Salha等，1998；Trounson和Gardner 1993)。在这样的基本培养基中，这些卵母细胞缺乏天然的卵泡液环境。因此，例如，Merriman等1998洗涤这些卵母细胞，在转移到在其中发生体外受精的基本培养基中之前在含有FSH和EGF的培养基中培养本专利技术详述本专利技术所解决的一个问题是体外创造的前成胚的非常低的着床率(rate of implantation)。这通过将一个或多个卵母细胞与精子一起暴露和培养于一种培养基中而实现，此培养基包括至少一种减数分裂活化甾醇(MAS)-MAS是位于羊毛甾醇和胆固醇之间的代谢途径中任何甾醇，一种MAS类似物，和/或能够内源性刺激至少一种MAS累积的添加剂或多种添加剂。根据本专利技术，在其中发生实际的体外受精的培养基，基于在实施例中给出的发现。因此，在实施例2中证明，与被暴露于对照培养的那些比较，人类的着床率在体外受精期间被暴露于含有FSH和EGF的培养基的卵母细胞和前成胚的组中显著更高。而且，与对照培养基比较，FSH和EGF的存在引起FF-MAS和T-MAS在卵母细胞已经在其中生长的培养基中累积。在实施例1中证明，在小鼠中，FSH和EGF在丘包封的卵母细胞的培养中的存在，通过减弱T-MAS向胆固醇的转变导致内生性合成的FF-MAS和T-MAS的累积。实施例1和2不仅表明，当在含有体内观察的那些浓度左右的EGF和FSH的培养基中进行体外受精时，着床率显著提高，而且证实根本的机制是MAS的内源性生产，而且其它实施例强调了这些发现。实施例3证明，在体外FSH和EGF提高了小鼠卵母细胞的卵母细胞成熟，并且，FSH和EGF的组合似乎增强了这个作用。实施例5证明，一种甾醇14-还原酶抑制剂(AY9944-17)按照剂量依赖性的方式刺激丘包封的小鼠卵母细胞的卵母细胞成熟，并且，AY化合物在丘包封的小鼠卵母细胞的培养中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种包括－至少一种减数分裂活化甾醇（ＭＡＳ），ＭＡＳ是在羊毛甾醇和胆固醇之间代谢途径中任何甾醇，－一种ＭＡＳ类似物，或者－能够内源性刺激至少一种ＭＡＳ累积的添加剂或多种添加剂的培养基用于体外受精的用途，其中从体外受精产生的前成胚 具有改善的体内着床率。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：CY安德森，AG拜斯克夫，
申请(专利权)人：诺沃挪第克公司，舍林股份公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]