一种以24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)为靶点进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种以24‑脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)为靶点进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法。包括以下步骤：1)确定DHCR24的分子结构；2)采用分子对接软件，依据链甾醇与DHCR24对接后的结合口袋，确定药物小分子对接的活性中心，设定活性口袋；3)整理对接用小分子配体数据库；4)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋依次进行对接；5)对初步对接筛选出的结果，进行精确对接，确定具有降胆固醇作用效果的候选药物。采用本发明专利技术可以在短时间内从现有小分子数据库中，获得具有DHCR24竞争性抑制作用，并开发为新型降胆固醇药物的小分子候选药物，大大提高研发效率，缩短新药研究周期。

A 24 dehydrocholesterol reductase (DHCR24) of virtual screening method for cholesterol lowering drugs targeting

The invention relates to a 24 dehydrocholesterol reductase (DHCR24) of virtual screening method for cholesterol lowering drugs targeting. Includes the following steps: 1) to determine the molecular structure of DHCR24; 2) using molecular docking software, on the basis of the binding pocket chain sterols after docking with DHCR24, to determine the active center of small drug molecular docking, set the active pocket; 3) finishing with a small molecule ligand docking database; 4) according to the active pocket set, using molecular docking the software will be docking with small molecule ligands and the active site of small molecule ligands in the database sequentially docking; 5) on the results of preliminary docking screening, precise docking, determine a cholesterol lowering effect of the drug candidate. The invention can be used in a short period of time from the existing small molecule database, with inhibition of DHCR24 competition, and for the development of small molecule drug candidate novel cholesterol lowering drugs, greatly improve the development efficiency, shorten the research cycle of new drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种以24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)为靶点进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法
本专利技术涉及药物筛选方法，尤其是以24-脱氢胆固醇还原酶(3β-脱氢胆固醇-Δ24还原酶，3β-hydroxysterolΔ-24-reductase，DHCR24)为靶点，利用分子对接软件，对小分子数据库进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法。
技术介绍
胆固醇是人体组织细胞不可或缺的重要物质，但胆固醇含量过高却会诱发产生疾病，尤其是心血管疾病。2016年5月是我国首个“胆固醇月”。根据《中国心血管病报告2014》最新数据显示，我国心血管病患者约为2.9亿，且患病率仍在持续升高。我国心血管病死亡率的上升趋势，主要是由于胆固醇引起的缺血性心脏病死亡上升所致。根据研究数据表明，中国人冠心病死亡率增加77％，主要是由于胆固醇升高所引起。而在众多危险因素当中，胆固醇指标的异常是导致心肌梗死、冠心病等疾病的重要危险因素。在人体内胆固醇来源主要通过两条途径：内源性的胆固醇的生物合成和肠道对摄入食物中胆固醇的摄取与吸收，其中内源性合成占80％左右。在食物摄入方面，可以通过人为控制，来达到一定程度的降低胆固醇的目的。但胆固醇的内源性合成是由遗传的因素来决定的。因而从内源性合成方面控制胆固醇的生成，是降低胆固醇的有效思路。例如目前临床普遍使用的他汀类降胆固醇药物，就是控制内源性胆固醇的生物合成来实现药效的。但是，他汀类药物的作用机理是通过竞争性抑制胆固醇生物合成过程初始阶段的酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂来实现。然而需要长期服用的他汀类药物，却存在合并高血糖、高血压、肌肉疾病以及肝酶升高等副作用，并且存在一部分高血脂病人对他汀类药物不敏感。3β-脱氢胆固醇-Δ24还原酶(DHCR24)是催化胆固醇合成最后一步的酶，催化链甾醇合成胆固醇。因此以DHCR24为靶点，通过开发DHCR24抑制剂进行新型降胆固醇药物的研发，意义重大。传统的药物筛选方法。例如无论是高通量细胞平台还是动物水平筛选，从确认有效成分，到分离单体，到最终成药上市，需要投入大量的人力，物力。因而寻找到一种高效的药物筛选方法就变得尤为重要。伴随着计算机的广泛发展，利用计算机技术进行虚拟筛选的方法，逐步被重视并得到应用。虚拟筛选是利用对接软件模拟分子间的相互作用，从而计算出分子间的亲和能大小，初步预测潜在的药物分子。目前的研究表明，这种虚拟筛选的阳性率可以高达20％左右，远远大于传统的新药筛选方法，从而可以节约大量的时间和研发成本，大大缩短了研发的周期和资金投入。因此虚拟筛选这种近年来不断发展完善的新型方法，在药物研发中受到了越来越广泛的关注和重视。目前被广泛使用的小分子数据库很多，例如DrugBank，TCM。这些数据库已经被频繁使用于新药的虚拟筛选研发与设计，其中包括以现有临床正在使用的药物和处于研发阶段的小分子药物数据库，如DrugBank(http://www.drugbank.ca/)可以被用来针对“老药”进行筛选加以“新用”，也可以大大提高开发的效率。“老药新用”是指已上市药物的新适应证或者新的用途开发。全新药物的研发一般从确立项目到上市需要10多年时间，成本也极高，而成功率却不足10％。“老药新用”则可以大大减少研发的风险性。因而利用小分子数据库，尤其是以“老药新用”的小分子药物数据库进行虚拟筛选研究，建立一种高效的DHCR24为靶点的新型降胆固醇药物筛选体系意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种创新性的，高效性的以DHCR24为靶点，利用现有小分子药物数据库或者其他小分子数据库进行新型降胆固醇药物的虚拟筛选方法。本专利技术利用目前较为先进的计算机虚拟筛选技术，结合已知小分子数据库，特别是小分子药物数据库，旨在从现有小分子数据库中，发现能竞争性抑制链甾醇与DHCR24(即以链甾醇与DHCR24结合口袋为靶点)结合从而降低胆固醇合成的新型小分子药物，以达到老药新用，提高药物筛选效率，节约时间，降低成本的目的。DHCR24基因的长度约为46.4kb，包含有9个外显子以及8个内含子，位于染色体的lp31.1-p33，DHCR24序列中还包含有保守结构域，能与FAD等非共价结合，表现出FAD依赖型氧化还原酶类家族的特征。因此在对接时也要同时将FAD对于链甾醇和DHCR24结合所产生的影响考虑在内。人源DHCR24蛋白由516个氨基酸组成，其末端具有FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)结合域及位于N端的信号肽。在人体中DHCR24基因突变(如E191K、N294T、K306N、Y471S和两点突变N294T/K306N)，导致DHCR24酶活性降低，引起胆甾醇血症，多为多发性的先天性畸形及发育异常，病因为与发育相关的能与胆固醇共价结合的Hedgehog蛋白信号通路发生异常导致。其表现特征是链甾醇在组织和血浆中的积累及胆固醇的缺失。低胆固醇血症导致的先天性畸形主要原因也是由于胎儿不能有效地从母体摄入足够的外源性胆固醇，而内源性合成又因为DHCR24的活性异常低下而造成。成人则有相对稳定的胆固醇调节机制，通过调节胆固醇的生物合成和外源供给而实现细胞内胆固醇维持在较为稳定的水平。目前已知存在小分子抑制剂DMHCA(N,N-dimethyl-3β-hydroxycholenamide)，可以通过竞争性机制抑制DHCR24活性(ThomasPfeiferandetal.,CurrPharmBiotechnol.2011)；以及U18666A可以通过非竞争性抑制机制抑制其活性，从而降低胆固醇的含量(BaeSHandetal.BiochemJ.,1997)。这两种抑制剂均可以通过抑制DHCR24活性发挥降低胆固醇作用，证明DHCR24的突变或者活性抑制可以影响胆固醇的含量，为通过抑制其酶活性来开发降胆固醇药物提供了理论基础。基于上述机理，本专利技术构思如下：由于目前DHCR24的晶体结构目前还未被测得，首先需要在UniProt上下载DHCR24蛋白的氨基酸序列，用同源建模的方法获得其三维结构，并确定其结构的合理性。如果DHCR24结构被测得，可以直接从共享的蛋白质数据库中获得其晶体结构数据。在chimspider上下载黄素腺嘌呤二核苷酸(flavinadenosinedinucleotideFAD)与链甾醇(desmosterol)的结构数据。在此基础上，利用对接软件Autodockvina1.1.2，将DHCR24蛋白分子先与FAD按照全局搜索策略对接，根据DHCR24蛋白结构域的基本信息，确定DHCR24-FAD复合物最佳构象；之后以此为基础，对接底物链甾醇，进行全局搜索对接，根据打分结果，确定几种组分的最佳结合构象，以此确定DHCR24酶的底物催化活性口袋。选用小分子数据库(如Drugbank数据库)作为药物小分子来源，并对其小分子结构进行适合用于筛选的处理。从drugbank几千种小分子药物中筛选出与活性口袋亲和性较好的小分子药物，并将链甾醇与DHCR24的对接结果作为对照，初步确定出能竞争性抑制底物链甾醇与DHCR24结合的候选药物小分子。最后挑选得到的候选药物小分子，进行细胞水平的降胆固醇效果的验证。本方法提供了一种全新的利用DHCR24为靶点的新型降胆固醇药物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以24‑脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)为靶点进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：1)确定DHCR24的分子结构；2)对DHCR24进行前期处理和优化；3)采用分子对接软件，依据链甾醇与DHCR24对接后的结合构象，确定药物小分子对接的活性中心，设定活性口袋；4)整理对接用小分子配体数据库，并进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选；5)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋依次进行对接；6)对初步对接筛选出的结果，进行精确对接，对药物小分子配体与活性口袋的相互作用方式，进行综合性评估，初步确定具有降胆固醇作用效果的药物。

【技术特征摘要】
1.一种以24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)为靶点进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：1)确定DHCR24的分子结构；2)对DHCR24进行前期处理和优化；3)采用分子对接软件，依据链甾醇与DHCR24对接后的结合构象，确定药物小分子对接的活性中心，设定活性口袋；4)整理对接用小分子配体数据库，并进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选；5)根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋依次进行对接；6)对初步对接筛选出的结果，进行精确对接，对药物小分子配体与活性口袋的相互作用方式，进行综合性评估，初步确定具有降胆固醇作用效果的药物。2.根据权利要求1所述的一种以24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)为靶点进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法，其特征在于：所述的步骤1)确定DHCR24的分子结构，包括：利用同源建模方法构建DHCR24的三维结构模型，利用打分软件进行打分，确定打分较高的结构模型作为DHCR24蛋白的三维结构模型；或者直接从网上蛋白质数据库下载DHCR24蛋白的晶体结构数据。3.根据权利要求1所述的一种以24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)为靶点进行降胆固醇药物的虚拟筛选方法，其特征在于：所述的步骤2)对DHCR24进行前期处理和优化，包括：加非极性氢，去除水分子，加电荷。4.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：芦秀丽，赵琳琳，史晓倩，杨晓雄，高兵，魏杰，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21