一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法。该方法包括：将大豆干细胞培养物冻干，粉碎，进行亚临界萃取，得到萃取物粗品；然后结晶纯化，得到植物甾醇精品。本发明专利技术首次以含有高含量植物甾醇的大豆干细胞培养物为原料提取制备植物甾醇，为植物甾醇的提取提供了一种新途径；此外，本发明专利技术将亚临界萃取技术应用于植物甾醇的提取方面，不仅安全性高，而且能缩短生产周期，成本低，可得到较高的提取效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于天然产物提取
，尤其涉及一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法。
技术介绍
植物干细胞是所有植物细胞的起源，植物是由植物干细胞分裂形成的。植物干细胞技术被认为是21世纪生物
最具竞争力的技术之一。植物干细胞培养，是在传统组培技术的基础上，改进了现有方法，以植物干细胞为目标，诱导、分离和培养外植体，建立相应的干细胞培养体系。通过同步的植物干细胞培养，可实现次生代谢物批量生产的稳定性和目标活性物质的大量生产，为功能食品的研发提供大量的原材料。通过植物干细胞培养，不仅丰富了植物培养技术，而且为天然产物的商业化生产，乃至植物生物技术的发展，提供了新的研究方向和契机。植物甾醇是一种广泛存在于植物根、茎、叶、果实和种子中的一种天然活性成分，尤其在大豆中含量较高。植物甾醇的种类繁多，目前，从植物中鉴定出了250多种植物甾醇，它们主要以游离态、甾醇酯(脂肪酸酯和酚酸酯)、甾基糖苷和酰化甾基糖苷等形式存在。不同的植物种类，其含量不同，植物油及其加工副产物是植物甾醇最丰富的自然来源。植物甾醇在结构上与胆固醇相似，但是它比胆固醇更易形成胶束，可以降低胆固醇进入血液中的几率，从一定程度上限制外源胆固醇的摄入量，因此能够抑制人体对胆固醇的吸收、促进胆固醇的降解代谢、抑制胆固醇的生化合成等作用。此外植物甾醇可用于预防治疗冠状动脉粥样硬化类的心脏病，对治疗溃疡、皮肤鳞癌、宫颈癌等有明显的疗效，植物甾醇还是重要的甾体药物和维生素D3的生产原料。关于植物甾醇的提取方法有多种，其原理一般是基于原料组成、化学性质、物理性质及生化反应等方面的差异，如利用皂化、中和、酶解、溶解度、蒸气压、吸附力的差异及在不同温度、真空、表面活性剂下物理、化学性质变化等以分离除去非甾醇类物质。常见的提取方法有溶剂结晶法、络合法、皂化法、蒸馏法(简单蒸馏法、分子蒸馏法)、吸附法(柱吸附法、高压流体吸附法)、超临界CO2萃取法、酶法等。传统有机溶剂提取方法不但需要耗费大量溶剂，还牵涉到长时间较高温度提取，影响产品质量。目前，没有关于从植物干细胞培养物中提取植物甾醇的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法。该方法以含有高含量植物甾醇的大豆干细胞培养物为原料，为植物甾醇的提取提供一种新途径，同时结合亚临界萃取技术，提供一种工艺操作简单、安全性高、植物甾醇含量高的植物甾醇提取方法。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法，该方法包括：(1)将大豆干细胞培养物冻干，粉碎过20～80目筛，送入亚临界萃取器中，密闭萃取器，控制萃取器内的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)打入液化的萃取溶剂进行逆流萃取；(3)萃取结束后将萃取液打入蒸发罐，去除溶剂，得到萃取物粗品；(4)将萃取物粗品进行结晶纯化，得到植物甾醇。上述方法中，所述萃取溶剂优选为正丁烷或丙烷。进一步地，步骤(2)中，料液比为1∶(5～20)，萃取温度35～70℃，萃取时间30～60min，萃取压力0.1～1.0MPa，萃取次数2～4次。进一步地，步骤(3)中，去除溶剂时温度控制在20～65℃。进一步地，结晶纯化的步骤：取所述萃取物粗品，加入乙酸乙酯，料液比1∶(3～10)，用磁力搅拌器一边加热一边搅拌，加热温度控制在35～50℃，待样品完全溶解后停止加热和搅拌，自然降温结晶，降至室温后维持1～3h，抽滤得到植物甾醇精品。在本专利技术的上述方法中，本专利技术所使用的大豆干细胞培养物是通过下述方法制备获得的：(1)将大豆种子用乙醇溶液浸泡，无菌水冲洗后，再用次氯酸钠溶液浸泡，然后无菌水冲洗，获得无菌大豆；(2)取上述无菌大豆的下胚轴，将其切成长度为1.5-2.5mm，获取无菌大豆组织；(3)将获得的无菌大豆组织，接种于诱导培养基进行诱导培养，获得愈伤组织，其中，1g无菌大豆组织接种于25-35mL的诱导培养基；(4)将上述获得的愈伤组织，接种于增殖培养基，摇床培养，同时于第2天开始进行稳态磁场干预，即可获得富含植物甾醇的大豆干细胞培养物；所述诱导培养基为含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mg/L柠檬酸铵和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，pH调至6.0-6.3；所述增殖培养基为含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培养基，pH调至6.8-7.0。进一步地，上述方法中，所述乙醇溶液的质量浓度为75-90％，次氯酸钠溶液的质量浓度为2-10％。进一步地，所述诱导培养为暗培养，温度为30-32℃，6-7天为一个培养周期，优选培养2-3个培养周期。进一步地，所述增殖培养温度为30-32℃，光照10-12h/d，摇床培养转速为110-130r/min，7天为一个培养周期，优选培养2-3个培养周期。进一步地，在增殖培养中，稳态磁场干预具体参数为每个培养周期中加载稳态磁场5-6天，每天曝磁6-8h，强度为0.9-3T。本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了一种工艺操作简单、安全性高的植物甾醇提取方法：首先传统上提取植物甾醇的原料多为植物油脱臭馏出物，本专利技术以含有高含量植物甾醇的大豆干细胞培养物为原料，该原料不仅植物甾醇含量高，而且制备周期短，经检测大豆干细胞中植物甾醇含量不低于6000mg/100g，普通大豆中植物甾醇含量大约为310mg/100g，二者植物甾醇含量相差近20倍，而且大豆干细胞培养周期仅为普通大豆生长周期的1/3，可见本专利技术所述的大豆干细胞培养物不仅缩短了生长周期，而且降低了生产成本，为植物甾醇的提取用原料提供了一种新途径。其次本专利技术采用亚临界萃取技术，整个萃取过程中低温、低压，可有效保护植物甾醇活性不被破坏，工艺简单，对设备要求低，溶剂残留少，产品不仅安全性高而且可大幅度提高植物甾醇提取率，提取成本低，最终得到含量和纯度都较高的植物甾醇，因此应用亚临界萃取技术提取制备大豆干细胞培养物中植物甾醇具有很大的应用价值。应用本专利技术提取制备的植物甾醇提取率达5.95％，提取物中植物甾醇相对纯度达97.98％。附图说明图1植物甾醇亚临界萃取工艺流程图。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术，下面结合优选实施例对本专利技术做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本专利技术的保护范围。实施例1富含植物甾醇大豆干细胞培养物的培养：一、培养基配制1、诱导培养基：含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、15-17mol/L柠檬酸铵和0.1-0.5mg/L萘乙酸的MS培养基，pH调至6.0-6.3；所述增殖培养基为2、增殖培养基：含8-28mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-2.5mg/L的蔗糖和0.1-0.5mg/L水解酪蛋白的MS培养基，pH调至6.8-7.0。二、获取无菌大豆将大豆种子用质量浓度为75-90％的乙醇浸泡15min，无菌水洗净；用质量浓度为2-10％的次氯酸钠浸泡2-5min，无菌水洗净；取上述无菌大豆下胚轴，将其切成长度为1.5-2.5mm。三、诱导培养取按照上述方法获得的无菌大豆组织，放于以上所述诱导培养基中，于30-32℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法，其特征在于，该方法包括：(1)将大豆干细胞培养物冻干，粉碎过20～80目筛，送入亚临界萃取器中，密闭萃取器，控制萃取器内的真空度至‑0.5～‑0.8MPa；(2)打入液化的萃取溶剂进行逆流萃取；(3)萃取结束后将萃取液打入蒸发罐，去除溶剂，得到萃取物粗品；(4)将萃取物粗品进行结晶纯化，得到植物甾醇。

【技术特征摘要】
1.一种从大豆干细胞培养物中提取植物甾醇的方法，其特征在于，该方法包括：(1)将大豆干细胞培养物冻干，粉碎过20～80目筛，送入亚临界萃取器中，密闭萃取器，控制萃取器内的真空度至-0.5～-0.8MPa；(2)打入液化的萃取溶剂进行逆流萃取；(3)萃取结束后将萃取液打入蒸发罐，去除溶剂，得到萃取物粗品；(4)将萃取物粗品进行结晶纯化，得到植物甾醇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取溶剂为正丁烷或丙烷。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张合亮，袁立军，刘颖，
申请(专利权)人：宝健北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11