在液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种在液体培养基中培养食用型担子菌纲真菌如蘑菇类Ａｇａｒｉｃｕｓ　Ｂｌａｚｅｉ　Ｍｕｒｉｌｌ以产生几厘米大小的真菌团聚体的有效方法。特征性地，该液体培养基以粗制甘蔗糖类形式的蔗糖为碳源，还含有不溶于水的可支持生长的细粉状物质作为真菌团聚体的核心，这种细粉状物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、松树和麸皮。进一步特征性地，培养过程在富含氧的条件下进行，该条件通过在０．１２－０．５ＭＰａ（绝对值）的压力下以一定的送气速度向培养基中输入富含氧的空气，其中氧的体积比至少为３０％。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的有效的新方法，或更具体地，本专利技术涉及一种在含水液体培养基中培养担子菌纲食用真菌，以获得所述真菌的数厘米大小的菌体团聚体的方法，所述真菌如蘑菇Agaricus Blazei Murill，香菇小丝膜菌(Cortinellus shiitake)，Lyophyllumaggregatum，Pleurotus ostreatus等。本专利技术还涉及实践所述培养方法的生物反应器。
技术介绍
是已知的，如美国专利2,693,665、2,761,246和2,850,841等。现有技术中一种典型的液体培养基在每升中包含50g蔗糖，10g硝酸铵，5g磷酸钠，2.5g硫酸镁，和0.2g硫酸亚铁。接种了真菌菌体如菌丝体的液体培养基通常用较低转速的搅拌器温和搅拌并通气数天，使菌丝体长成直径3-40mm的球形或多面形粒状团聚体。这种菌丝体团聚体被认为借助菌丝体表面形成的、作用类似粘合剂的粘性多糖物质而形成。但现有技术中这些方法的产率很低，其原因包括该真菌的低生长速率以及当真菌在培养基中培养时回收真菌遇到的困难。本专利技术因此旨在提供在液体培养基中培养担子菌纲真菌，如蘑菇Agaricus Blazei Murill(本文称为蘑菇属真菌)等的有效工业化新方法。本专利技术的第二个目的是提供适于在真菌液体培养基中实施上述培养方法的新的生物反应器。专利技术公开因此，本专利技术在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法包括以下步骤(a)在含有提供氮、磷酸和钾的无机营养盐的液体培养基中接种真菌菌体如菌丝体； (b)将该液体培养基与粗制甘蔗糖混合，所述甘蔗糖的量为每升液体培养基50-70g蔗糖；(c)将该液体培养基与不溶于水的支持生长的物质混合，所述支持生长的物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、和麸皮，其量为每升液体培养基0.2-15g干重；(d)使该液体培养基在20-30℃一直搅拌；(e)在0.12-0.5MPa(绝对值)的压力下，以至少0.01升/min/升液体培养基的速率，向该液体培养基中通以富含氧的空气，该富氧空气中至少30％的体积，或优选60-90％的体积为氧气。实施本专利技术上述培养方法的生物反应器包括(A)一个可承受压力的容器，其用于容纳液体培养基；(B)一个进气管，其能以0.12-0.5MPa(绝对值)的超大气压力将富含氧的空气吹入液体培养基；(C)一个出气管，其具有将可承受压力的容器内的压力调节在0.12-0.5MPa(绝对值)范围内的装置(means)；和(D)一种装置，其能对所述可承受压力之容器内容纳的液体培养基进行搅拌。附图简述附图说明图1是实施本专利技术方法的一种典型生物反应器系统的剖视图。图2是实施本专利技术方法的另一种生物反应器系统的剖视图。图3是实施本专利技术方法的又一种生物反应器系统的剖视图。图4是实施本专利技术的连续方法的生物反应器系统剖视图。图5显示蘑菇属真菌在各种液体培养基中的生长曲线。图6显示从配备了气体旋流器(cyclone)(实线)或未配备(虚线)的生物反应器中出来的薄雾中蘑菇属真菌的菌丝体浓度。实施本专利技术的最佳模式如上述，本专利技术培养担子菌纲真菌，或主要是蘑菇属真菌的方法，其特征在于液体培养基的组成和在这种液体培养基中进行培养的条件。当在最优选条件下培养时，只要培养基中提供了足够的营养，真菌菌体的团聚体就可快速生长至直径10-20mm，但团聚体的核心有时表现为黑色，可能是液体培养基中局部缺乏溶解氧的结果。该问题可如下解决，即通过将培养基中溶解氧的浓度增加至15-30mg/L，以使真菌团聚体经3-4天的连续培养可生长至直径约40mm而核心部分不发黑。无机营养盐的种类和浓度无特殊限制，可常规包括10-15g/L硝酸铵作为氮源，5-7g/L磷酸钠作为磷酸盐来源，3-7g/L硫酸钾或磷酸氢二钾作为钾离子来源，2.5-3.5g/L硫酸镁和0.2-0.3g/L硫酸亚铁。本专利技术培养方法中所用的液体培养基的特征是，与作为碳源的蔗糖混合，所述蔗糖并非纯糖形式，而是粗制甘蔗糖。粗制甘蔗糖在液体培养基中的起始量相当于纯蔗糖40-200g/L。加入培养基的蔗糖必需是粗制甘蔗糖而非甜菜糖。但对粗制甘蔗糖的这一限制原因不明，假定，来自甘蔗或甜菜的粗制糖除了糖以外总是含有相当量的杂质，粗制糖杂质的种类在粗制甘蔗糖和粗制甜菜糖中不同，粗制甘蔗糖中所含杂质，包括某些金属元素如镁、锌和钴以及其它不明痕量元素对于促进蘑菇属真菌的生长特别有效。另一特征是，使本专利技术所用液体培养基与不溶于水的支持生长的物质混合，所述支持生长的物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、和麸皮以及粉碎的松树组织，包括木质部分、树叶和果实，所述支持生长的物质的量为0.2-15g干物质/L。加入培养基中的这种支持生长的物质应为能通过100目(mesh)，或优选200目(在Tyler标准中)筛孔的精细颗粒。这些支持生长的物质颗粒可作为真菌团聚体更稳定生长的核心。本专利技术人当然已进行了广泛筛选试验，以排除来自各种植物的其它支持生长的物质，包括细颗粒形式的玉米(Indian com)的茎和叶、米糠、大麦谷粒及桑椹的叶子和其它部分，结论是，所述支持生长效应和稳定效应特异性针对粉碎的甘蔗、甘蔗渣、麸皮以及松树组织。当在上述液体培养基中实施本专利技术培养担子菌纲真菌如蘑菇属真菌的方法时，第一步是在含有上述各种成分的液体培养基中接种真菌菌体，优选接种真菌的菌丝体。导致本专利技术的最意外的发现是，通过向上述液体培养基中加压吹入富含氧的空气，致使溶解氧浓度为至少7mg O2/L液体培养基，从而在富氧条件下实施本专利技术的培养方法，可大大促进蘑菇属真菌的生长并获得稳定性。为了实现溶解氧的这一浓度，吹进液体培养基中的富氧空气含有至少30％体积的氧气，或优选30-90％体积的氧气，且富氧空气被加以0.12-0.5MPa(绝对值)的压力。富氧空气的吹气速率当然比较重要，应至少0.01L/min/L液体培养基。吹气速率没有特定的上限，但考虑到由生物反应器的出气管排出的薄雾逐渐消散，吹气速率优选为0.01-1.0L/min/L液体培养基。显然，吹入液体培养基中的富氧空气必须是无菌的，例如使其通过适当滤膜以使该液体培养基被各种(可能抑制所需担子菌纲真菌稳定生长的)微生物污染的危险性减至最小。为了获得最佳培养效果，培养蘑菇属真菌的温度当然十分重要。担子菌纲真菌的培养温度通常应为20-30℃，应在该范围内针对具体真菌物种选择最佳培养温度。当温度太低或太高时，真菌的生长速率降低，这是不利的当满足以上各种因素的要求时，在分批方法中培养蘑菇属真菌可在两至三天内完成。这里应注意，真菌快速生长的结果是，真菌菌体对碳源营养的同化作用产生大量二氧化碳气体。除非气相中二氧化碳被充分除去，真菌菌体的生长会由于液体培养基的pH值降低而被抑制，所述pH值有时降至3.5或更低，这种pH值的降低是真菌菌丝体的酸性外分泌造成的，其伴有由于液体培养基上层气相中氧分压的降低所致的溶解氧浓度的降低。以下通过参照附图举例说明本专利技术的培养方法以及用于该方法的生物反应器。图1是一种生物反应器系统，其包括一个由可承受压力的柱体1构成的培养容器，在该容器1的下部有带分流器5A的进气管5，出气管6与该容器1的上部相连，带有浆叶的搅拌器7由顶部的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在含水液体培养基中培养担子菌纲真菌的方法，其包括以下步骤： （ａ）在含有能提供氮、磷酸和钾的无机营养盐的液体培养基中接种真菌菌体； （ｂ）将该液体培养基与粗制甘蔗糖混合，所述甘蔗糖的量相当于每升液体培养基５０－７０ｇ蔗糖； （ｃ）将该液体培养基与不溶于水的支持生长的物质混合，所述支持生长的物质选自粉碎的甘蔗、甘蔗渣、松树组织、和麸皮，其量为每升液体培养基０．２－１５ｇ干重； （ｄ）使该液体培养基在２０－３０℃一直搅拌； （ｅ）在０．１２－０．５ＭＰａ（绝对值）的压力下，以至少０．０１升／ｍｉｎ／升液体培养基的速率，向该液体培养基中通以富含氧的空气，该富氧空气中至少３０％的体积为氧气。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：前川孝昭，院多本华夫，
申请(专利权)人：筑波生物系统有限会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]