施氏假单胞菌Zh9944和防治青枯病的微生物制剂制造技术

本发明专利技术涉及一种细菌及以该细菌为主要成分的防治作物的青枯病的微生物制剂。所述的细菌为施氏假单胞菌Ｚｈ９９４４。所述的防治青枯病的微生物制剂，以施氏假单胞菌Ｚｈ９９４４为活性成分，以禾本科植物种皮粉或茎杆粉为载体，每克载体含有活菌数５００亿ＣＦＵ以上；含水量为８～１５％。本发明专利技术的微生物制剂是一种高效、无毒、安全、无残留的新型微生物农药。对因青枯假单胞菌引起的烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很强的抑制作用，田间防效达６０～８０％左右。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种细菌及其筛选方法和以该细菌为主要成分的防治作物如烟草、番茄等的青枯病的微生物制剂。由青枯病假单胞菌引起的青枯病发病于烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等等作物，迄今为止尚未发现有效的农药以及防治方法。本专利技术的目的是提供一种施氏假单胞菌及其筛选方法和以该细菌为主要成分的防治青枯病的微生物制剂。实现本专利技术目的中的提供一种施氏假单胞菌的技术方案是施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)Zh9944(以下简称为PSZh9944菌株)，于1999年3月自我国江苏省常州市郊区的番茄青枯病发生地区的采集样品中分离筛选而得，已于2000年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为NO.0494。上述施氏假单胞菌的分离筛选和菌株的获得方法是，采用平皿相互拮抗筛选模型与定向筛选相结合的方法，其技术路线为(1)在烟草、番茄等青枯病发生地区的田块中采集发病株和健康株的根、茎和根围土；(2)从采集样品中分离菌株；(3)通过分离菌株间的平皿相互拮抗试验和分离菌株的致病性试验，区分出拮抗菌株和病原菌株两类；(4)以拮抗率、反拮抗率等生物学参数分析拮抗菌、病原菌和其他类之间相互关系以及在细菌分类上属假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)或芽孢杆菌(Bacillsspp.)选取拮抗菌株；(5)选出的拮抗菌株通过田间小区多点试验以田间防效不小于60％为基准挑选有效菌株。PSZh9944菌株具有下述性质1、形态特征用光学显微镜及电子显微镜观察菌株。结果表明菌株为单个杆状细胞，大小为0.8×1.5～3.8微米，革兰氏染色菌体为红色、呈阴性，不形成芽孢，以单生极毛运动，在营养琼脂上产生铜绿色水溶性色素，不产生荧光色素及脓青素。在营养琼脂培养基上，菌落圆形，表面光滑，有光泽，边缘较整齐，浅灰蓝色，半透明，30℃培养48小时，菌落直径在0.5～2.0毫米左右。2、菌株的生理生化特征专性好氧，在厌氧条件下能进行反硝化作用，不需要生长因子，在细胞内不积储聚-β-羟基丁酸盐颗粒，水解明胶，不水解淀粉，在蔗糖培养基上不产生果聚糖。其它生理生化特征如下氧化酶(+)； 接触酶 (+)；O/F测定为氧化型产酸； H2S (-)；赖氨酸脱羧酶 (-)；精氨酸双水解酶(-)；M.R.反应 (-)；色氨酸脱氨酶 (-)；吲哚试验 (+)；V.P.反应 (-)；脲酶 (-)；41℃生长 (+)；精氨酸脱羧酶 (+)。由于该菌株革兰氏试验呈阴性G(-)，直的杆状，以单生极毛运动，氧化酶(+)，O/F为氧化型，在厌氧条件下能进行反硝化作用，接触酶阳性，在细胞内不积累聚-β-羟基丁酸盐颗粒，不产生荧光色素，在41℃能生长等特征，可归为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。菌株PSZh9944与施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)模式菌株比较存在相异如下在培养特征上，生长物不粘连在培养物上，始终光滑，呈浅灰蓝色，在营养琼脂上产生铜绿色水溶性色素，在生理生化性质上，PSZh9944水解明胶，不水解淀粉，不能利用麦芽糖。实现本专利技术目的中的提供一种防治青枯病的微生物制剂的技术方案是该微生物制剂为粉剂，以禾本科植物种皮粉、茎干粉为载体，以施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)Zh9944 CGMCC NO.0494为活性成分，每克载体含有活性菌数500亿CFU以上。上述载体可以是砻糠粉、麸皮粉、稻杆粉、麦杆粉、高粱杆粉或玉米杆粉。优选的载体是砻糠粉，砻糠粉的粒度以能通过20～60目筛为准，粉剂的颜色为褐色至土黄色。上述载体含有活性菌数的优选范围是每克1000～6000亿CFU。培养方法可以用常规的微生物制剂发醇罐方法培养PSZh9944。所得的培养液以一定的比例与砻糠粉混合，物料含水量应降低在15％以内，约为8％～15％，即制得本专利技术所述的微生物制剂。培养方法为液体培养，将生产菌的菌悬浮液接种到培养基上，并进行通气搅拌。对培养基的营养源并无特殊的规定，其中碳源为淀粉、葡萄糖，不宜用蔗糖。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、玉米浆等，其它营养源，例如磷酸盐、硫酸镁等可适当添加。对温度限定在29～31℃之间，pH值可保持在消后6.9～7.0，培养时间为20～24小时。发醇罐培养终止后，及时将培养液与砻糠以适合比例混合，并在干燥通风的条件下，使物料含水量为8％～15％以内，活菌量保持在每克500亿CFU以上。如以上所得的微生物制剂具有下述物理与生物性质1、形状褐色至土黄色粉末。2、含活菌量每克500亿活菌以上；以下毒性试验中含活菌量为每克3000亿活菌。3、急性毒性分级大鼠经口LD50＞4640mg/kg，大鼠经皮LD50＞2000mg/kg。按GB-15670-1995“农药登记毒理学试验方法”中农药急性毒性分级标准，属低毒类农药。4、急性眼睛皮肤刺激分级急性眼刺激积分指数为2(1小时)，急性皮肤刺激分值为0(1小时)。按GB-15670-1995“农药登记毒理学试验方法”中农药急性皮肤眼睛刺激分级标准，对眼睛、皮肤均无刺激性。5、对鸟类、鱼类、蜜蜂、家蚕的毒性安全性评价对鸟类，用高于最高使用浓度一倍的溶液一次性剂量直接经口注入灌胃，经10天试验观察无死亡现象及其他中毒症状，说明鹌鹑对粉剂的耐受剂量LD0＞100亿CFU/kg，因此，正常使用该生物制剂对鸟类是安全的。对鱼类，斑马鱼在高于最高使用浓度一倍的溶液中，经一周试验观察，无死亡现象及其他中毒症状，斑马鱼对粉剂的最大耐受浓度LC0＞300倍稀释液(10000亿CFU/升)。因此，正常使用该生物制剂对鱼类是安全的。对蜜蜂，以田间常用量及两倍田间常用量的药液对蜜蜂进行胃杀毒性和触杀毒性试验，受试蜜蜂在试验观察期内均未出现中毒症状及死亡现象。该生物制剂对蜜蜂低毒，正常使用时对蜜蜂安全。对家蚕，以田间常用量及两倍田间常用量的药液浸渍过的桑叶饲喂受试二龄起蚕，24小时后改喂未浸药桑叶，受试家蚕在24小时、48小时，至三龄起蚕的观察期内未出现中毒症状及死亡。继续观察至四龄起，生长正常。以上结果表明，该生物制剂对蚕低毒，正常使用对家蚕安全。本专利技术具有积极的效果(1)由于因青枯假单胞菌引起的青枯病日趋严重(包括感病程度、作物和地区的上升和扩展)，迄今为止无任何农药可治。本专利技术所提供的可以有效用于防治细菌性青枯病的细菌菌株以PSZh9944为主要成分制造出微生物农药，是一种高效、无毒、安全、无残留的新型微生物农药。(2)PSZh9944能在感病作物体内外拮抗青枯病原菌。该菌株具有在感病作物根际土壤中繁殖的能力，并向作物根部聚集和进入根组织内部，向上转移至茎。并且定植于根和茎的韧皮部薄壁细胞间，构成所谓“拮抗防线”，并与感病作物形成互生关系。PSZh9944对青枯假单胞菌拮抗能力的大小与向田间接种PSZh9944的菌量成对应关系。(3)本专利技术的微生物制剂对因青枯假单胞菌引起的烟草、番茄、花生、茄子、辣椒等植物的青枯病有很强的抑制作用，田间防效达60～80％左右。(4)本专利技术所述的PSZh9944为主的微生物制剂不仅对青枯假单胞菌引起的青枯病害有治疗作用，而且使受施作物具有对青枯病害本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种施氏假单胞菌，其特征在于：施氏假单胞菌Ｚｈ９９４４，已于２０００年９月２６日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为ＣＧＭＣＣ，保藏编号为ＮＯ．０４９４。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仲华，张春明，任炽麓，安凤霞，任敏，张逸庆，张华泉，
申请(专利权)人：常州兰陵制药有限公司，张春明，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]