由原核核酸结合蛋白介导的分子物质转移法制造技术

本发明专利技术涉及一种将分子物质诸如蛋白质或核酸转移进细胞的方法，假设使用的ＤＮＡ与可能基因表达相关。本发明专利技术采用了一种用于转移的原核核酸结合蛋白，此蛋白优选来源为嗜热生物。当被转移物质是核酸时，该蛋白与核酸形成一种可逆复合物。这种原核蛋白可浓缩和压缩核酸分子。通过适当的温育作用后所述核酸可以被吸收进靶细胞中。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

和现有技术状况转染是指，为了实现基因在细胞中的表达，引入核酸，如核苷酸、反义RNA、核酶、尤其是以质粒、染色体或染色体片段形式存在的DNA的过程。在此所用，术语转移是与之类似的，而在通常语言惯用法中，术语转染专门用于描述基因转移。除了核酸转移以外，附加活性物质如蛋白、肽、治疗药物和其他分子物质的定向有效转化也很重要。转移过程在生物医学基础研究和生物技术制药工业领域均具有重要意义。一些蛋白，其中含有治疗相关蛋白，只有在真核细胞中生产时，才能正确加工，因为甚至在翻译后也能对蛋白进行修饰的修饰机器在原核生物中多半不存在或者显著不同。相反，其它蛋白则利于在原核宿主细胞中生产，因为在原核宿主细胞中，可以经济方便地生产大量蛋白。此外，特定基因的转染和定向表达是一种在细胞和分子生物学中对生物过程进行定性描述和分析的重要手段。谈及产生具有新特性和含有新成分的植物(转基因植物)或抗除草剂植物，细胞转染是植物技术中一种重要方法。最后，在生物医学研究领域，定时用单链核酸(单链DNA或单链RNA)，或核酸衍生物转染细胞，这些物质作为效应子发生细胞内效应，例如通过所谓反义核酸技术专一性抑制蛋白合成。对于所有这些过程和方法中，相关核酸的特定转移是重要工序。同样地，可以直接地将蛋白或肽运输进细胞的方法也是有关联的；此方法最重要的应用在治疗领域。例如，细胞内的抗体可被用来识别细胞内特定病原体并抑制它们。实现这一目的的一种方法是大分子物质进入靶细胞的电穿孔法；但是这种方法只能在体内应用，效率低并对细胞存在相对高的浪费(参见E.J.Verspohl，I.Kaiserling-Buddemeier，A.Wienecke，将特异抗体导入电渗透细胞是一种去除细胞特定功能的重要方法，Cell.Biochem.Funct.Vol.15，127-134，1997)。根据目前技术水平，对于将核酸转移进细胞而言，已有几种方法。其中有，如同前面提及的蛋白转移方法一样的物理方法，例如电穿孔法，其中通过与电场接触，细胞膜被穿孔，从而使大分子物质可以透过。然而，对于敏感细胞而言，电穿孔法常常存在困难，并且伴随低的细胞存活率。就真核细胞来说，根据现有技术水平，最常使用化学法，例如磷酸钙与DNA共沉淀法、高分子复合物形成法，如从DEAE-(二乙氨乙基-)葡聚糖法和DNA(参见Y.W.Yang & J.C.Yang，DEAE-葡聚糖介导的基因转移研究，Biotechnol.Appl.Biochem.1997，Vol.25，47-51)或带有DNA的树状体形成法(参见J.F.Kukowska-Latallo，A.U.Bielinska，J.Johnson，R.Spindler，D.A.Tomalia，& J.R.BakerJr.，利用Starburst聚酰胺型胺类树状体法将遗传物质高效转移进哺乳动物细胞，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，Vol.93，4897-4902)。这些转染试剂的作用机制是首先，将长的具有一定机械强度的线状核酸分子进行压缩；在多数情况下，这种压缩是核酸成功吸收进入细胞的重要先决条件。偶尔，可以利用多聚阳离子例如纯的或修饰的多聚赖氨酸介导转移(例如，参见专利WO 98/06869)。在医药应用中，优选以阳离子脂类物质为基础的脂质体系统进行转移；该系统具有高效的优点。于是，出现了用不同来源和成分的的阳离子脂质体包合核酸的包合物(参见商业产品，如Invitrogen公司的PerFect，Roche公司的FuGene，Life Technologies公司的Lipofectamine，Biontex公司的PolyFectin，及Stratagene公司的LipoTaxi)。有关此方面的全面、最新的综述可以参见文献R.J.Lee&L.Huang，进行基因转移的脂类载体系统，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.1997，Vol.14，173-206。相当大量国际专利主要区别就在于所用脂质体的配方不同。然而，这些所述的技术和试剂分别具有不同的缺点。一方面，现存系统(除了基于脂质体的系统)效率相当低，产量只占被转染细胞的几个百分点。另一方面，有效试剂(基于脂质体的)往往会增加毒性，尤其对敏感真核细胞。其他的不良特点也已被描述；例如用DEAE-葡聚糖法转染依附的真核细胞时，微弱附着的细胞会从细胞培养皿的底部产生脱落。而且，没有立即表现细胞毒性的转染试剂可能具有影响转染后细胞的特性。另外，现有的新一代转染试剂如树状体(Superfect产品，Qiagen公司生产)虽然在一定的应用中仅具有微弱的毒性，但是制作相当复杂，所以很昂贵。最后，迄今为止，很多转染方法要求使用者进行大量操作，所以使用中表现出复杂和繁琐的特点；这也可能对转染分析的再现性负面影响。为达到最大转染量，必须分别针对每种细胞类型对制造商要求的转染标准方法进行修改，并且每次进行最优化实验。这些试剂大多仅适于双链DNA的运输，极少适用于单链核酸的运输，特别不适用于其他分子物质如蛋白或肽。最后一点但不是最不重要的，目前常用的转染试剂各自的组成仅为一种或少数几种分子，因而，它们的应用范围受到局限。专利技术的任务就在于消除或减少上面列举的根据现有技术水平所存在的的缺点。因此，根据本专利技术，提供了一种如权利要求1所述的用于将核酸和/或核酸类似物、和/或多种核酸和/或多种核酸类似物和/或含氨基酸物质转移进原核或真核细胞的方法，其中●用于转移的核酸或核酸类似物，或多种核酸或多种核酸类似物，或含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白接触，从而产生核酸、核酸类似物或多种核酸或多种核酸类似物或含氨基酸物质与此种原核核酸结合蛋白的复合物。和●随之，通过这种核酸、核酸类似物和/或多种核酸或多种核酸类似物及含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白形成的复合物与原核或真核靶细胞接触，以便实现将复合物转移进细胞。本专利技术的有利应用形式来自于本专利技术说明部分的次要权利要求。专利技术概述本专利技术涉及一种用于将核酸、核酸类似物、和/或多种核酸和/或核酸类似物、和/或含氨基酸物质，尤其是核酸例如以质粒形式存在的DNA，转移进入原核或真核细胞的方法。为了达到这一目的，通过一种原核核酸结合蛋白，在适宜的温育条件下与被转移物质的共价结合，或与被转移核酸的非共价缔合形成复合物，然后将复合体加入靶细胞中。这种原核核酸结合蛋白所具有的浓缩DNA的特性在这里特别有利于以DNA为基础活性物质的转移。对于控制吸收和增加效率而言，原核核酸结合蛋白能表现出另外的特点，例如，附加融合的形式。细胞可分别吸收蛋白和活性物质的复合体，蛋白和核酸的复合体。不同形试图示于附图说明图1中。本转移方法中用到了原核核酸结合蛋白，优选地来自耐热生物，更优选地来自极端嗜热生物。当核酸用作转移物质时，原核核酸结合蛋白与核酸形成可逆复合体；原核核酸结合蛋白浓缩并压缩核酸。这样，复合物可以被保护不会受到令人不快的效应的作用，例如，核酸酶的降解效应。在分别温育之后，用这种方法浓缩的核酸分子可以通过真核细胞膜或原核细胞壁被吸收进入细胞，不论是被动还是主动过程。如果一个编码基因以相应的DNA(例如，质粒)形式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于将核酸和／或核酸类似物，和／或多种核酸和／或多种核酸类似物和／或含氨基酸物质转移进入原核或真核细胞的方法，其中：.被转移的核酸或核酸类似物，或多种核酸或多种核酸类似物，或含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白接触，以便形成核酸，核酸类似物或多种核酸，多种核酸类似物及含氨基酸物质与此种原核核酸结合蛋白的复合物，和.随后，这种由核酸、核酸类似物和／或多种核酸或多种核酸类似物及含氨基酸物质与原核核酸结合蛋白形成的复合物与原核或真核靶细胞接触，以便实现该复合物转移进细胞的过程。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G伯姆，D埃塞尔，
申请(专利权)人：ACGT前基因组公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]