大蹼铃蟾神经营养肽及其制备方法和其基因技术

本发明专利技术涉及大蹼铃蟾神经营养肽及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。其神经营养肽为从中国两栖类动物大蹼铃蟾（Ｂｏｍｂｉｎａ ｍａｘｉｍａ）皮肤分泌物中分离得到的由７７个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量８０４４．７，等电点８．４，多肽氨基酸全序列一级结构为：ＡＶＩＴＧＶＣＤＲＤＡＱＣＧＳＧＴＣＣＡＡＳＡＦＳＲＮＩＲＦＣＶＰＬＧＮＮＧＥＥＣＨＰＡＳＨＫＶＰＹＮＧＫＲＬＳＳＬＣＰＣＮＴＧＬＴＣＳＫＳＧＥＫＦＱＣＳ。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码神经营养肽的基因由４０４个核苷酸组成，其中编码成熟神经营养肽为第１０２－３３２位核苷酸。其基因作为基因工程制备神经营养肽的应用。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)神经营养肽及其制备方法和其基因，属生物医学领域。脑的增龄性变化从20多岁就已经开始，到50多岁后在有些脑区如额叶皮层呈现明显的退行性变化，在黑质和蓝斑的神经细胞的数量减少到30％-40％。与脑的老年性退行性变化有关的疾病主要有帕金森氏病，阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化等疾病。动物实验研究表明，神经营养肽对神经细胞具有保护作用，可以减缓神经细胞的衰老和修复神经细胞的损伤，增强学习与记忆能力。因此，神经营养肽已成为开发新型预防和治疗老年性疾病药物的热点。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药专利技术的热点。据文献报道，国外学者已从东方铃蟾(Bombina orientalis)中分离出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到的降压肽类物质bufokinin和ranakinin有舒张血管和降血压的作用，已在治疗心血管疾病方面显示出诱人的应用前景；最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。近十几年对170多种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景。专利技术人将本专利技术的大蹼铃蟾神经营养肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽，与从欧洲花铃蟾(Bombina variegata)皮肤中得到的神经营养肽Bv8有11个氨基酸的差异。专利技术人将本专利技术的神经营养肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。本专利技术的目的是基于上述现有技术基础，提供一种主要用于开发减缓神经细胞衰老和修复神经细胞损伤，增强学习记忆和治疗老年性疾病药物的大蹼铃蟾神经营养肽及其制备方法和其基因。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案大蹼铃蟾神经营养肽，为我们从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由77个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量8044.7，等电点8.4，多肽氨基酸全序列一级结构为丙氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-甘氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-谷胺酰胺-半胱氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丝氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-组氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-组氨酸-赖氨酸-缬氨酸-脯氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-赖氨酸-精氨酸-亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-天冬酰胺-苏氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-赖氨酸-丝氨酸-甘氨酸-谷氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-丝氨酸。AVITGVCDRDAQCGSGTCCAASAFSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCNTGLTCSKSGEKFQCS大蹼铃蟾神经营养肽的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，冷冻干燥后，分子筛凝胶过滤分离，收取所得峰III再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化，取第二步HPLC反相C18柱层析分离出的峰(箭头所示)即可。然后用HPLC方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。大蹼铃蟾神经营养肽具有显著的神经细胞保护营养作用，作为制备神经性疾病，抗衰老，增强学习记忆治疗药物的应用。大蹼铃蟾神经营养肽基因的克隆包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，在欧洲花铃蟾神经营养肽Bv8编码信号肽的核苷酸序列的基础上设计引物，利用PCR方法筛选大蹼铃蟾神经营养肽基因。根据Bv8编码信号肽核苷酸序列所设计的扩增引物LR52，其长度为24个核苷酸，其序列为5’TTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGC3’，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码大蹼铃蟾神经营养肽的基因由404个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为CAAGAACTTTAGTCCTGAGGTTTAGTTTTACTATTCAGTTTATCATGAAGTGTTTTGCACAGATTGTGGTGTTGCTGCTTGTCATAGCCTTCTCACACGGTGCTGTCATCACTGGGGTATGTGATAGAGACGCACAGTGCGGGTCAGGTACCTGTTGTGCTGCCAGTGCGTTTTCACGTAACATCAGATTTTGCGTCCCACTTGGAAATAACGGGGAGGAATGTCACCCAGCCAGCCATAAGGTGCCTTATAATGGAAAGCGGTTGAGTTCCTTGTGCCCCTGCAACACCGGACTAACTTGCTCCAAGTCTGGAGAAAAATTTCAGTGTTCTTAATAGTGATATTAAGTGAAAATGTAAAAGGACAATAAAACATGAGCCTTGTAAATTAAAAAAAAAAAAAAA其中编码成熟大蹼铃蟾神经营养肽为第102-332位核苷酸，其氨基酸序列为AVITGVCDRDAQCGSGTCCAASAFSRNIRFCVPLGNNGEECHPASHKVPYNGKRLSSLCPCNTGLTCSKSGEKFQCS大蹼铃蟾神经营养肽基因作为基因工程制备神经营养肽的应用。下面结合附图用实施例来进一步详述本专利技术，但本专利技术的内容并不局限于此。附图说明图1为本专利技术大蹼铃蟾神经营养肽的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。图2为本专利技术大蹼铃蟾神经营养肽的HPLC反相C18柱层析图。图3为本专利技术大蹼铃蟾神经营养肽基因核苷酸序列。图4为本专利技术成熟大蹼铃蟾神经营养肽氨基酸序列。实施例一1，制备大蹼铃蟾神经营养肽活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。第一步SephadexG-50凝胶过滤按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，p本文档来自技高网...

【技术保护点】
大蹼铃蟾神经营养肽，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由７７个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量８０４４．７，等电点８．４，多肽氨基酸全序列一级结构为：丙氨酸－缬氨酸－异亮氨酸－苏氨酸－甘氨酸－缬氨酸－半胱氨酸－天冬氨酸－精氨酸－天冬氨酸－丙氨酸－谷胺酰胺－半胱氨酸－甘氨酸－丝氨酸－甘氨酸－苏氨酸－半胱氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－丙氨酸－丝氨酸－丙氨酸－苯丙氨酸－丝氨酸－精氨酸－天冬酰胺－异亮氨酸－精氨酸－苯丙氨酸－半胱氨酸－缬氨酸－脯氨酸－亮氨酸－甘氨酸－天冬酰胺－天冬酰胺－甘氨酸－谷氨酸－谷氨酸－半胱氨酸－组氨酸－脯氨酸－丙氨酸－丝氨酸－组氨酸－赖氨酸－缬氨酸－脯氨酸－酪氨酸－天冬酰胺－甘氨酸－赖氨酸－精氨酸－亮氨酸－丝氨酸－丝氨酸－亮氨酸－半胱氨酸－脯氨酸－半胱氨酸－天冬酰胺－苏氨酸－甘氨酸－亮氨酸－苏氨酸－半胱氨酸－丝氨酸－赖氨酸－丝氨酸－甘氨酸－谷氨酸－赖氨酸－苯丙氨酸－谷胺酰胺－半胱氨酸－丝氨酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，赖仞，李文辉，刘衡，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]