饱食因子及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种饱食因子及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。该饱食因子为从中国两栖类动物大蹼铃蟾（Ｂｏｍｂｉｎａｍａｘｉｍａ）皮肤分泌物中分离得到的由２８个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量３２２９．５７，等电点７．７，多肽氨基酸全序列一级结构为：ＡｓｐＭｅｔＴｙｒＧｌｕＩｌｅＬｙｓＧｌｎＴｙｒＬｙｓＴｈｅＡｌａＨｉｓＧｌｙＡｒｇＰｒｏＰｒｏＩｌｅＣｙｓＡｌａＰｒｏＧｌｙＧｌｕＧｌｎＣｙｓＰｒｏＩｌｅＴｒｐＶａｌ－ＡＭＩＤＡＴＩＯＮ。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、离子交换柱层析、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码饱食因子的基因由１０４１个核苷酸组成，其中编码成熟饱食因子为第８３５－９１８位核苷酸。具有抑制进食，增强缓激肽生物效应的作用，作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)饱食因子及其制备方法和其基因，属生物医学领域。缓激肽(bradykinin)是一类神经内分泌多肽，具有广泛而复杂的生物学效应，主要包括肌肉收缩，降血压，增加血管通透性。目前主要用于研究和开发心血管系统药物(5)。很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效(6)。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物(7)。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药专利技术的热点(8)。据文献报道，国外学者已从东方铃蟾(Bombina orientalis)中分离出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到的降压肽类物质bufokinin和ranakinin有舒张血管和降血压的作用，已在治疗心血管疾病方面显示出诱人的应用前景(9)；最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。近十几年对几百种两栖类皮肤活性肽和有机小分子进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景(10)。专利技术人将本专利技术的饱食因子全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。专利技术人将本专利技术的饱食因子编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。参考文献1，孙志娟，黄之瑜，肥胖的研究进展。生理科学进展，2001，32(1)，39-44。2，Schwartz MW，Woods SC，Jr Porte D，Central nervous system control offood intake.Nature，2000，404，661-671.3，Bray GA，Tartaglia LA，Medical strategies in the treatment of obesity.Nature，2000，404，672-677.4，Couce ME，Green D，Brunetto A，Achim C，Lloyd RV，Burguera B.Limitedbrain access for leptin in obesity.Pituitary 2001 Jan-Apr；4(1-2)，101-10.5，陈修，陈维洲，曾贵云，心血管药理学，1998版，北京，人民卫生出版社。6，江苏新医学院，中药大词典，1997版，上海，上海科学技术出版社。7，叶昌嫒，费梁，胡淑琴，中国珍稀及经济两栖动物，1993，成都，四川科学技术出版社。8，Lazarus，L.H.，Attila，M.，1993.The toad，ugly and venomous，wearsyet a precious jewel in his skin.Prog.Neurobiol.41，473-507.9，Clarke BT，1997.The Natural History of Amphibian Skin Secretions，Their Normal Function and Potential Medical Applications.Biol Rev，72(3)，365-379.10，赖仞，赵宇，刘衡，张玉洁，李文辉，张云，两栖类动物皮肤活性物质的利用兼论中国两栖类资源开发的策略。动物学研究，2002，23(1)，65-70。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案饱食因子，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为天冬氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-氨基化缬氨酸(Asp Met Tyr Glu IleLys Gln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu GlnCys Pro Ile Trp Val-AMIDATION)，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。饱食因子的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，冷冻干燥后，经Sephadex G-50分子筛凝胶过滤分离，收取所得峰V再经CM-Sephadex C-25阳离子交换分离得到4个分离峰，峰I经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化即可得到该饱食因子(箭头所示)。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardmentmass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。饱食因子作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。饱食因子基因的克隆包括大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，根据编码大蹼铃蟾缓激肽的基因序列设计引物，利用PCR方法筛选新型饱食物因子基因。PCR扩增引物LR115，其长度为21个核苷酸，其序列为5’GATTTGCCNAAGATCAACCGN 3’，PCR另一扩增引物为位于克隆插入部分的3’端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码饱食因子的基因由1041个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列为cagttctgta acaagttctc agtgtcactt ccagctctga tcatgagact gtggttctgt 60ctaagtttct tcattgtcct gtgcctggag cattttacag gaaccctggc agatgaaagg 120aatgttccag agagtgaaga aaaaactgag cagttcctga gggatttgcc taagatcaac 180cgcaaaggac cacgtccacc ggggttctcc ccttttcgag gaaaattcca tagccagtcc 240ctgcgggatt tgcctaagat caaccgcaaa ggaccacgtc caccggggtt ctcccctttt 300cgaggaaaat tccatagcca gtccctgcgg gatttgccta agatcaaccg caaaggacca 360cgtccacc本文档来自技高网...

【技术保护点】
饱食因子，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由２８个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量３２２９．５７，等电点７．７，多肽氨基酸全序列一级结构为：天冬氨酸－甲硫氨酸－酪氨酸－谷氨酸－异亮氨酸－赖氨酸－谷氨酰胺－酪氨酸－赖氨酸－苏氨酸－丙氨酸－组氨酸－甘氨酸－精氨酸－脯氨酸－脯氨酸－异亮氨酸－半胱氨酸－丙氨酸－脯氨酸－甘氨酸－谷氨酸－谷氨酰胺－半胱氨酸－脯氨酸－异亮氨酸－色氨酸－氨基化缬氨酸，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张云，赖仞，刘衡，李文辉，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]