表达荧光蛋白质的转基因小鼠制造技术

产生了非人转基因哺乳动物，这些哺乳动物的基因组中掺入了哺乳动物的ｎｅｓｔｉｎ基因的调节序列的ＤＮＡ，调节序列是与编码标记／报道分子蛋白质的基因可操作地连接的。调节序列可以含有一个启动子和存在于哺乳动物ｎｅｓｔｉｎ基因中的第二个内含子的序列。标记／报道分子蛋白质优选地是荧光蛋白质，例如绿荧光蛋白质，该蛋白质经修饰以增强荧光。在非转基因哺乳动物或其子代的器官中观察到了多能的，和特别是，神经干和祖先细胞群体。多能的干和祖先细胞可以从非人的转基因哺乳动物，子代或其胚，例如通过ＦＡＣＳ，而不通过组织培养直接分离。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请本申请是1999年，11月19日递交的美国专利申请编号09/444,335的部分继续申请，该申请的全部内容引入作为参考。神经干和祖先细胞通常是从发育中的或成人的脑中得到的，并作为细胞培养物长时期培养。可以鉴定，分离和扩展表达某些标记，例如nestin的集落。但是，从这一方法获得的细胞在培养中经过了重复传代，不再是最初收获的细胞。原初细胞的特征特性可能丢失。例如，在体外培养中的时间延长可能导致产生的祖先细胞，尽管仍然没有完全分化成神经细胞(神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞，等等)，但已经丢失了真正的多能神经干细胞特征。另外，上面的技术不允许分离保留区域特异性并表达特异于一个或另一个中枢神经系统的区域的标记，而同时保留他们产生各种类型的分化细胞的能力的多能早期祖先细胞。所以，能够直接从动物或胚胎分离干和祖先细胞而不需要延长体外培养的方法是存在需要的。本专利技术进一步涉及生产在多能干和祖先细胞中表达荧光蛋白质的非人祖先哺乳动物的方法。该方法包括在非人哺乳动物受精卵中导入含有与编码荧光蛋白质的基因可操作地连接的哺乳动物nestin基因的调节序列的DNA，荧光蛋白质是在非人哺乳动物的多能干和祖先细胞中表达的。将含有包括哺乳动物nestin基因的调节序列的DNA的受精卵导入允许产生子代的同一种类的非人哺乳动物中，调节序列与编码荧光蛋白质的基因可操作地连接。子代是非人转基因哺乳动物。该方法进一步包括从上面得到的非转基因哺乳动物中选择多能干和祖先细胞表达荧光基因的非人转基因哺乳动物子代。另外，本专利技术涉及表达构建体或载体，和含有它的细胞。表达构建体包括启动子序列，编码绿荧光的蛋白质的基因和存在于哺乳动物nestin基因的第二个内含子中的调节序列。在优选的实施方案中，启动子是nestin基因的启动子。本专利技术也涉及本专利技术也涉及测定动物器官或其区域中的多能干和祖先细胞群体的方法。该方法包括测量发荧光的来自非人转基因哺乳动物的器官或其区域的细胞，非人转基因哺乳动物在它的基因组中整合了含有与编码荧光蛋白质的基因可操作地连接的哺乳动物nestin基因的调节序列的DNA，其中编码荧光蛋白质的基因是在非人转基因哺乳动物中的多能干细胞和祖先细胞中表达的。发荧光的细胞是多能干细胞和祖先细胞。本专利技术同时涉及的是得到原初的，非培养的多能干细胞的方法，包括从非人转基因哺乳动物，其子代或胚胎分离表达标记/报道分子蛋白质(例如，荧光蛋白质)的细胞，非人转基因哺乳动物已经在它的基因组中整合了含有哺乳动物nestin基因的调节序列的DNA，调节序列与编码标记/报道分子蛋白质(例如，荧光蛋白质)的基因可操作地连接。编码标记/报道分子蛋白质的基因是在非人转基因哺乳动物，其子代或胚胎的多能干和子代细胞中表达。在一个实施方案中，多能干和祖先细胞是神经干和祖先细胞。在另一个实施方案中，标记/报道分子蛋白质是在多能干和祖先细胞中表达的。仍然在另一个实施方案中，标记/报道分子蛋白质是荧光蛋白质，并且，荧光细胞是通过荧光激活细胞分拣分离的。本专利技术也涉及通过这些方法得到或分离的细胞。另外，本专利技术涉及评估化合物促进多能干和祖先细胞分化的能力的方法。该方法包括能够分化的多能干和祖先细胞与待评估的化合物接触，确定在存在化合物时或细胞中标记/报道分子蛋白质的测量；和将存在化合物时细胞的标记/报道分子蛋白质的测量和活对照细胞的标记/报道分子蛋白质的测量比较，多能干和祖先细胞的基因组中已经整合了含有与编码标记/报道分子蛋白质(荧光蛋白质)的基因可操作地连接的哺乳动物nestin基因的调节序列的DNA，其中编码标记/报道分子蛋白质的基因是在多能干和祖先细胞中表达的。在存在化合物时或细胞的标记/报道分子蛋白质的测量与活对照细胞的标记/报道分子蛋白质的测量比较时的减少或缺乏是该化合物促进多能干和祖先细胞分化的能力的证据。本专利技术的其它方面涉及评估化合物的促进全能干和祖先细胞分化成多能干和祖先细胞的能力。在该方法中，将活的全能干和祖先细胞与待评估的化合物接触。活的全能干和祖先细胞的基因组中整合了含有哺乳动物nestin基因的调节序列，该调节序列与编码标记/报道分子蛋白质的基因(例如，编码荧光蛋白质的基因)可操作地连接，其中标记/报道分子基因是在细胞中表达的。确定在存在化合物时细胞的标记/报道分子蛋白质(例如荧光)的测量，并与对照细胞中的标记/报道分子蛋白质的测量比较。在存在化合物时的细胞的测定的标记/报道分子蛋白质与对照的标记/报道分子蛋白质的测量比较时的增加是全能细胞分化成多能干和祖先细胞的证据。同样，本专利技术涉及评估化合物促进多能干和祖先细胞分化成神经细胞的能力的方法。在这一方法中，如果研究的细胞是多能干和祖先细胞，在存在化合物时的细胞的标记/报道分子蛋白质(例如荧光)的测量与对照细胞的标记/报道分子蛋白质的测量比较时减少是化合物促进多能干和祖先细胞分化成神经细胞的能力的证据。本专利技术具有许多优点。例如，通过实施本专利技术，可以直接得到完整的多能干和祖先细胞以及完整的神经干和祖先细胞，而没有延长体外的培养。产生的细胞保留了区域特异性而同时保留了产生各种类型的分化细胞的能力。另外，本专利技术的方法产生的细胞可以用于评估促进分化的化合物和对细胞有毒性的化合物。另外，本专利技术的方法允许在动物模型中研究多能干和祖先细胞。例如，为了跟踪体内给药的化合物的效果，研究在脑损伤后或移植实验后，胚胎期和胚胎后时期的过程中，正常脑中的神经发生。也可以检测正常的器官发育过程和移植后的细胞迁移。另外，本专利技术提供了评估化合物促进干和祖先细胞和神经干和祖先细胞的分化的能力的方法。由于完整的细胞可以从特异的器官或其区域分离和由于整合进细胞的涉及基因表达的调节元素是已知的，可以鉴定对于细胞亚系潜在地是独立的细胞特异基因，蛋白质，表面抗原，和其它细胞特异标记。图2图解了包括nestin启动子，编码绿荧光蛋白质的基因序列，nestin基因的第二个内含子序列的表达构建体。图3A-3C和3G表示了来自对照细胞的荧光激活细胞分拣(FACS)的结果。图3D-3F和3H-3N表示了从非人转基因哺乳动物得到的细胞的FACS。本专利技术的详细说明本专利技术涉及基因组中已经整合了含有哺乳动物nestin基因的调节序列的DNA的非人转基因哺乳动物或其子代。与哺乳动物nestin基因的调节序列可操作地连接的是编码标记/报道分子蛋白质如荧光蛋白质的基因。标记/报道分子蛋白质是在非人转基因哺乳动物子代或其胚胎的多能干和祖先细胞中表达的。任何适当的非人哺乳动物可以用于生产如上所述的非人转基因哺乳动物。如本文所用，术语“非人转基因哺乳动物”包括非人转基因哺乳动物的新生儿，年幼的子代，发育的成熟动物，胚胎，以及非人转基因哺乳动物的子代的新生儿，年幼子代，发育成熟的动物或胚胎。非人转基因动物和它们的子代的例子包括小鼠，大鼠，狗，猴子，以及任何适当的非人哺乳动物种类。优选的哺乳动物是小鼠。通常，干细胞认为是具有不对称分裂的能力的细胞，产生一个拷贝的自身和一个更定型的子细胞。通常，干细胞被认为是具有增殖，展示自身维护，产生大量子代，和应答损伤或疾病产生新细胞的能力的未分化细胞。通常祖先细胞是更定型的细胞，分裂不对称并且可以分化成更成熟的形态型。如本文所用，术本文档来自技高网...

【技术保护点】
在基因组中整合了含有哺乳动物ｎｅｓｔｉｎ基因的调节序列的ＤＮＡ的非人转基因哺乳动物，其子代或胚胎，调节序列与编码荧光蛋白质的基因可操作地连接，其中编码荧光蛋白质的基因是在非人转基因哺乳动物，其子代的多能干和祖先细胞中表达的。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：格雷高里N艾妮科洛波夫，约翰米格诺尼，
申请(专利权)人：冷泉港实验室，
类型：发明
国别省市：US[美国]