有生命的线虫体内程序性死亡细胞的检测制造技术

本发明专利技术涉及通过将有生命的线虫暴露在染色程序性死亡细胞的活体染料中，检测程序性死亡细胞，在有生命的线虫体内检测程序性死亡细胞的方法和工具。对这种检测方法的应用包括确定调节程序性细胞死亡的试剂，条件或基因的方法。本发明专利技术还包括筛查表现出改变的程序性细胞死亡的突变线虫的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
相关申请本申请要求1998年6月19日提交的编号60/090,057临时申请的权益，该临时申请的内容通过在此引述而合并于本文。能在活体内筛查调节细胞程序性死亡的条件或试剂的检测将显著地推进对这些疾病的治疗。在有生命的生物体内研究试剂或条件的作用可提供如何使用试剂或条件更精确的描绘。因此，存在一种需要能在有生命的生物体内快速并有效地筛查细胞程序性死亡调节试剂或条件的检测方法。本专利技术的另一个实施方案涉及在有生命的线虫(如Caenorhabditis elegans)体内确定试剂或条件对细胞程序性死亡的影响，包括将有生命的线虫暴露在要检测的试剂中或条件下；将线虫与活体染料接触以染色线虫体内的程序性死亡细胞；检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。线虫较好的是成年的。使用在本方法中的活体染料可以是任何活体染料，包括吖啶橙或SYTO染料(如SYTO12)。程序性死亡细胞可视觉检测。方法可进一步包括确定程序性死亡细胞的量和与对照物的比较。与对照物比较，程序性死亡细胞的量增加，说明试剂或条件诱导细胞程序性死亡。与对照物比较，程序性死亡细胞的量减少，说明试剂或条件抑制细胞程序性死亡。本专利技术还包括调节细胞程序性死亡的试剂，如由本文所描述的方法所确定的。本专利技术还包括在有生命的线虫(如Caenorhabditis elegans)体内确定要测试的至少一种基因表达的程序性细胞死亡作用的方法，其中在基因的至少一个区域制成突变，包括将有生命的线虫与活体染料接触以染色线虫体内的程序性死亡细胞，检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。方法进一步包括确定程序性死亡细胞的量并与对照物相比较。与对照物相比，程序性死亡细胞量的增加或减少，说明基因表达影响细胞程序性死亡。程序性死亡细胞量的增加说明基因的表达增强了细胞程序性死亡。程序性死亡细胞将的减少说明基因的表达抑制或减少了细胞程序性死亡。本专利技术还包括调节细胞程序性死亡的基因，如通过本文所述方法确定的。本专利技术涉及在有生命的线虫体内确定存在或不存在程序性死亡细胞的方法，包括提供已用改变线虫对辐射的敏感性的诱变剂处理的线虫；将有生命的线虫与活体染料接触以染色线虫体内的程序性死亡细胞；检测在有生命的线虫体内存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。该方法包括将线虫暴露在要测试的试剂中或条件下。在另一个实施方案中，本专利技术涉及确定含有经历了改变的程序性细胞死亡的细胞的、突变的有生命的生物体的方法，包括将生物体与调节细胞程序性死亡的试剂或条件接触，从而产生突变的有生命的生物体；将突变生物体与活体染料接触以染色生物体内的程序性死亡细胞；检测有生命的突变的生物体内存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞；选取含有经历了改变的程序性细胞死亡的细胞的突变生物体，与对照物相比。与对照物相比，突变体可以是对辐射有更强或更弱的敏感性。本专利技术包括突变的线虫，如依据这种方法确定的。本专利技术还涉及包括至少一种线虫(如Caenorhabditiselegans)，以及活体染料(如，吖啶橙或SYTO染料)的试剂盒。线虫可以是突变的，这样线虫对诱导程序性细胞死亡的辐射是敏感的或是不敏感的。图2A是对野生，ced-3,ced-4,rad-5,ced-9(gf)和egl-1(1f)线虫辐射后0,1 2,24,和36小时生殖细胞的程序性细胞死亡量的图示。图2B是对rad-5突变体和野生(WT)辐射(0Gy和120Gy)后1-8小时生殖细胞死亡的图示。图2C是野生线虫，rad-5突变体，ced-3突变体和ced-4突变体暴露在0-5mM的N-亚硝基-N-乙脲后生殖细胞死亡的图示。图3示意了分离信号途径加入到核心细胞程序性死亡方式中调节Caenorhabditis elegans体细胞死亡，生理学上的生殖细胞死亡和辐射诱导生殖细胞死亡。箭头表示激活；T-形图表示抑制。虚线箭头表示在egl-1(n3082)动物体内部分阻碍辐射诱导细胞死亡。图4A是用微分干涉相差(DIC)光学仪器直接观察评定生殖细胞死亡的成年雌雄同体的照片。图4B是用活体染料吖啶橙染色评定生殖细胞死亡的成年雌雄同体的照片。图5是三维图，显示了用6,12或24kRad的γ辐射照射后28小时的ced-3-n717和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。图6是三维图，显示了在暴露在5mM和1mM的N-亚硝基-N-乙脲后，处理后28小时的ced-3-n717和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。图7是三维图，显示了用6,12或24kJ的UV辐射，照射后24小时ced-3-n717和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。图8是三维图，显示了用1 2或24kRad的γ辐射照射后0,1,2,3,4,5,6,12和24小时的野生品系(N2)程序性生殖细胞死亡的平均数。图9是通过微分干涉相差(DIC)光学仪器和吖啶橙(AO)确定的，用12kRad的γ辐射后24小时野生品系(N2)程序性死亡生殖细胞的照片。附图说明图10是三维图，显示了用12kRad的γ辐射照射后24或48小时的rad-5和野生品系(N2)表现出程序性生殖细胞死亡量的虫子的数量。本专利技术的详细描述本专利技术涉及一种筛查影响(如增强或抑制)程序性细胞死亡(如DNA损伤诱导程序性细胞死亡)的试剂、条件或基因的检测方法。具体地，本专利技术涉及在用进行测试的试剂、条件或基因突变处理的有生命的生物体内检测程序性死亡细胞的方法。细胞程序性死亡是指涉及细胞的程序性死亡的细胞过程。细胞可能由于多种原因程序性死亡。程序性细胞死亡出现在形成身体的各部分的时候，如形成器官或分离出足趾和手指。程序性细胞死亡也出现在消除曾经有一定作用但不再需要的结构的时候，如现在是青蛙的蝌蚪的尾巴。程序性细胞死亡也发生在细胞暴露在应激条件下时，如辐射，紫外线(UV)，毒性药物等等。这样的应激作用能对细胞的DNA造成损伤，致使产生程序性细胞死亡的级联事件。经历程序性死亡的细胞缩小并在细胞的内容物溢出前被邻近的细胞吞没。暴露在剧烈应激条件下的细胞可能经历导致细胞肿胀并爆裂的坏死性，非计划死亡。爆裂致使细胞内容物溢出到它们的邻近细胞，从而引起损伤炎性反应(同上)。程序性死亡途径涉及导致细胞死亡的几个事件。在一种途径中，受体，称为“Fas受体”，在程序性死亡的细胞中表达。将Fas配体与Fas受体结合使得受体聚集，蛋白质，称为“procaspases,”彼此裂解激活开始自杀过程。同前。结果，某些基因是表达的或是灭活的。在虫子Caenorhabditis elegans中，基因，ced-3和ced-4是表达的，并激活程序性细胞死亡。其他基因的表达，如ced-9，抑制ced-3和ced-4激活程序性细胞死亡，参看图3。这样，当引发程序性细胞死亡时，ced-9部分或全部被灭活。损伤细胞DNA的应激作用可诱导程序性细胞死亡。研究DNA损伤诱导程序性细胞死亡途径提供了认识一些疾病如扩增性疾病，神经退行性变疾病，与细胞死亡有关的心脏或脑病况的发展和/或治疗。直到现在，还没有能使人快速有效地筛查大量程序性死亡细胞的检测方法。同样直到现在，还没有能使人在有生命的生物体内(活体)研究DAN损伤诱导程序性细胞死亡过程的程序性细胞死亡检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在有生命的线虫体内确定存在或不存在一种或多种程序性死亡细胞的方法，包括：（ａ）将有生命的线虫与活体染料接触染色线虫体内的程序性死亡细胞；（ｂ）检测存在或不存在被染料染色的程序性死亡细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：迈克O亨加特讷，安东加特讷，斯图尔特米尔斯坦，
申请(专利权)人：冷泉港实验室，
类型：发明
国别省市：US[美国]