浮萍的转化及其用途制造技术

本公开内容提供了用于浮萍科物种的遗传转化的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】政府资金本专利技术是在美国能源部授予的合同号DE-EE0003298和DE-AC02-98CH10886下由政府支持进行的。政府具有本专利技术的某些权利。背景石油可用性已成为当今时代的主要问题之一。在过去的十年中，石油消费量呈指数增加，而仅仅发现了少数的新油田和其它来源。事实上，根据美国中央情报局(CIA，2013年)的年度评估，预计在现有资源的情况下，社会将在不到50年内耗尽石油。此已知的稀缺性已产生了开发可再生能源的需要。概述浮萍科(Lemnaceae)物种(例如，膨胀浮萍(Lemnagibba)、青萍(Lemnaminor)和紫萍(Spirodelapolyrhiza))通常被称为浮萍或水扁豆(waterlentils)，其是世界上最小的水生有花植物。虽然它们是真正的单子叶被子植物，但它们具有非常退化的形态，包括生长的叶、简单的根和分生组织干细胞的两个“袋”。在最佳条件下浮萍具有指数生长速率，其可在30小时内使叶的数量加倍并且在一周内产生64克生物质/克起始重量，这远远超过了最快生长的玉米速率(2.3g/g/周)，并且不受次级产物例如木质素的阻碍。由于它们在边缘水生环境中的强健生长和优秀的代谢特征，浮萍科植物是生物燃料原料的有吸引力的选项。如本文所述，本公开的方法用于调节几种不同类别基因的表达，所述基因包括各种酶(例如，CH42，PDS，PDAT1和DGAT1)和转录因子(例如，WRI1b)。本公开的方法还用于在浮萍中稳定表达几种不同的外源启动子(例如，来自玉米的泛素启动子和来自CaMV的35S启动子)和内源启动子(例如，来自浮萍的肌动蛋白启动子)。因此，本公开的多个方面和实施方案提供了用于利用核酸稳定转化浮萍的方法，该方法包括下列顺序的步骤：(a)在包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的液体感染培养基中，使用包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因的工程改造的农杆菌(Agrobacterium)接种活跃生长的浮萍愈伤组织，从而产生接种的愈伤组织，(b)在包含乙酰丁香酮的半固体根瘤生产培养基上培养接种的愈伤组织，随后在包含选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养接种的愈伤组织，从而产生经培养的接种的愈伤组织；(c)从(b)的经培养的接种的愈伤组织选择表达可视报告基因的经转化的愈伤组织；(d)在包含所述选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养(c)中选出的愈伤组织；和(e)在半固体培养基上培养(d)中培养的愈伤组织，从而产生包含目标核酸的遗传改造的子代浮萍。在一些实施方案中，(d)的半固体培养基是包含选择物质和抗生素的半固体选择培养基。在一些实施方案中，农杆菌是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。例如，在一些实施方案中，根癌农杆菌是根癌农杆菌GV3101(在美国临时申请号61/868527中称为CV3101)。在一些实施方案中，活跃生长的浮萍愈伤组织是活跃生长的青萍(Lemnaminor)愈伤组织。例如，在一些实施方案中，活跃生长的青萍愈伤组织是活跃生长的青萍8627愈伤组织。在一些实施方案中，步骤(a)的活跃生长的浮萍愈伤组织的直径为3至5mm。在一些实施方案中，步骤(a)包括使浮萍愈伤组织与根癌农杆菌接触5分钟。在一些实施方案中，液体感染培养基包含硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮。在其它实施方案中，液体感染培养基由硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮组成。例如，在一些实施方案中，液体感染培养基由10mM硫酸镁、10g/L蔗糖和100μΜ至200μΜ乙酰丁香酮组成。在一些实施方案中，选择物质是DL-草胺膦。在一些实施方案中，可视报告基因是绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，步骤(b)的接种的愈伤组织在半固体根瘤生产培养基上培养2-4天。在一些实施方案中，步骤(b)的半固体根瘤生产培养基包含乙酰丁香酮、Murashige和Skoog基础盐、蔗糖、2,4-二氯苯氧乙酸和6-苄氨基嘌呤。在其它实施方案中，步骤(b)的半固体根瘤生产培养基包含100μΜ乙酰丁香酮、4.4g/LMurashige和Skoog基础盐、30g/L蔗糖、1μΜ2,4-二氯苯氧乙酸和2μΜ6-苄氨基嘌呤或由其组成。在一些实施方案中，步骤(b)的接种的愈伤组织在半固体选择培养基上培养4至7天。在一些实施方案中，步骤(b)的半固体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，步骤(b)的半固体选择培养基包含DL-草胺膦、基础盐、蔗糖、羧苄青霉素和cefotaxamin。在其它实施方案中，步骤(b)的半固体选择培养基由10mg/LDL-草胺膦、3.2g/LShenk和Hilderbrandt(SH)基础盐、10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素和500mg/Lcefotaxamin组成。在一些实施方案中，步骤(c)包括使用荧光显微镜选择荧光细胞。在一些实施方案中，将步骤(c)中选出的愈伤组织在液体选择培养基中培养约3至4周。在一些实施方案中，步骤(d)的液体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，步骤(d)的液体选择培养基包含DL-草胺膦、基础盐、蔗糖、羧苄青霉素和cefotaxamin。在其它实施方案中，步骤(d)的液体选择培养基包含10mg/LDL-草胺膦、3.2g/LShenk和Hilderbrandt(SH)基础盐、10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素和500mg/Lcefotaxamin或由其组成。在一些实施方案中，步骤(e)包括在半固体选择培养基上培养(d)中培养的愈伤组织直到遗传改造的子代浮萍是可视的。在一些实施方案中，步骤(e)的半固体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。在一些实施方案中，步骤(e)的半固体选择培养基包含DL-草胺膦、基础盐、蔗糖、羧苄青霉素和cefotaxamin。在其它实施方案中，步骤(e)的半固体选择培养基包含10mg/LDL-草胺膦、3.2g/LShenk和Hilderbrandt(SH)基础盐、10g/L蔗糖、200mg/L羧苄青霉素和500mg/Lcefotaxamin或由其组成。在一些实施方案中，目标核酸包含可操作地连接至编码目标蛋白质的核酸的启动子。在其它实施方案中，目标核酸包含可操作地连接至编码人工微小RNA的核酸的启动子。本公开的多个其它方面和实施方案提供了使用核酸瞬时转化浮萍的方法，该方法包括以下顺序的步骤：(a)在浮萍的分生组织中引入切口；(b)用(i)包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的感染培养基和(ii)工程改造的根癌农杆菌渗透所述切口，其中所述工程改造的根癌农杆菌包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因，从而产生经渗透的浮萍；(c)在包含选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养经渗透的浮萍，从而产生经培养的渗透的浮萍；和(d)鉴定(c)中表达可视报告基因的经培养的渗透的浮萍。在一些实施方案中，根癌农杆菌为根癌农杆菌GV3101。在一些实施方案中，浮萍是紫萍(Spirodelapolyrhiza)。例如，在一些实施方案中，紫萍是紫萍6581。在一些实施方案中，感染培养基包含硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮或由其组成。在一些实施方案中，感染培养基包含10mM硫酸镁、10g/L蔗糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用核酸稳定转化浮萍的方法，该方法包括：(a)在包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的液体感染培养基中，使用包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因的工程改造的农杆菌接种活跃生长的浮萍愈伤组织，从而产生接种的愈伤组织；(b)在包含乙酰丁香酮的半固体根瘤生产培养基上培养接种的愈伤组织，随后在包含选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养接种的愈伤组织，从而产生经培养的接种的愈伤组织；(c)从(b)的经培养的接种的愈伤组织选择表达所述可视报告基因的经转化的愈伤组织；(d)在包含所述选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养(c)中选出的愈伤组织；和(e)在包含所述选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养(d)中培养的愈伤组织，从而产生包含所述目标核酸的遗传改造的子代浮萍。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.21 US 61/868,5291.利用核酸稳定转化浮萍的方法，该方法包括：(a)在包含镁、植物可代谢糖和乙酰丁香酮的液体感染培养基中，使用包含目标核酸、可选择标记基因和可视报告基因的工程改造的农杆菌接种活跃生长的浮萍愈伤组织，从而产生接种的愈伤组织；(b)在包含乙酰丁香酮的半固体根瘤生产培养基上培养接种的愈伤组织，随后在包含选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养接种的愈伤组织，从而产生经培养的接种的愈伤组织；(c)从(b)的经培养的接种的愈伤组织选择表达所述可视报告基因的经转化的愈伤组织；(d)在包含所述选择物质和抗生素的液体选择培养基中培养(c)中选出的愈伤组织；和(e)在包含所述选择物质和抗生素的半固体选择培养基上培养(d)中培养的愈伤组织，从而产生包含所述目标核酸的遗传改造的子代浮萍。2.权利要求1的方法，其中所述农杆菌是根癌农杆菌。3.权利要求2的方法，其中所述根癌农杆菌是根癌农杆菌GV3101。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述活跃生长的浮萍愈伤组织是活跃生长的青萍愈伤组织。5.权利要求4的方法，其中所述活跃生长的青萍愈伤组织是活跃生长的青萍8627愈伤组织。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中(a)的活跃生长的浮萍愈伤组织的直径为约3至5mm。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中(a)包括使所述浮萍愈伤组织与根癌农杆菌接触5分钟。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述液体感染培养基包含硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮。9.权利要求8的方法，其中所述液体感染培养基由硫酸镁、蔗糖和乙酰丁香酮组成。10.权利要求9的方法，其中所述液体感染培养基由10mM硫酸镁、10g/L蔗糖和100μΜ至200μΜ乙酰丁香酮组成。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述选择物质是DL-草胺膦。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述可视报告基因是绿色荧光蛋白。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中(b)的经培养的接种的愈伤组织在半固体根瘤生产培养基上培养约2-4天。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中(b)的半固体根瘤生产培养基包含乙酰丁香酮、Murashige和Skoog基础盐、蔗糖、2,4-二氯苯氧乙酸和6-苄氨基嘌呤。15.权利要求14的方法，其中(b)的半固体根瘤生产培养基由100μΜ乙酰丁香酮、4.4g/LMurashige和Skoog基础盐、30g/L蔗糖、1μΜ2,4-二氯苯氧乙酸和2μΜ6-苄氨基嘌呤组成。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中(b)的经培养的接种的愈伤组织在半固体选择培养基上培养约4至7天。17.权利要求1-16中任一项的方法，其中(b)的半固体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。18.权利要求17的方法，其中(b)的半固体选择培养基包含DL-草胺膦、羧苄青霉素、cefotaxamin基础盐和蔗糖。19.权利要求18的方法，其中(b)的半固体选择培养基由10mg/LDL-草胺膦、200mg/L羧苄青霉素、500mg/Lcefotaxamin、3.2g/LShenk和Hilderbrandt(SH)基础盐和10g/L蔗糖组成。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中(c)包括使用荧光显微镜选择荧光细胞。21.权利要求1-20中任一项的方法，其中将(c)中选出的愈伤组织在液体选择培养基中培养约3至4周。22.权利要求1-21中任一项的方法，其中(d)的液体选择培养基包含选择物质、抗生素、基础盐和蔗糖。23.权利要求22的方法，其中(d)的液...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·马缇伊森，A·穆亚穆拉雷斯，C·P·亚里克斯，E·伊恩斯特，J·杉克林，Y·颜，
申请(专利权)人：冷泉港实验室，布罗克哈文科学协会有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US