修饰的DHPS基因制造技术

本发明专利技术涉及导致必需氨基酸在细胞中累积的生物合成关键酶的修饰。编码二氢吡啶二羧酸合酶（ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｐｉｃｏｌｉｎａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＤＨＰＳ）或其功能片段的重组或分离核酸或其功能片段中已被引入一突变，以用半胱氨酸置换至少一个单氨基酸残基。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及修饰生物合成的关键酶，以使必需氨基酸在细胞中累积。20种必需氨基酸中有10种以上人和单胃动物不能合成，因此必需从其饮食中获得这些必需氨基酸。必需氨基酸是赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸和色氨酸。另外，酪氨酸和半胱氨酸尽管不是严格意义上的必需氨酸，但因为它们只能自必需氨基酸中合成酪氨酸自苯丙氨酸中合成，半胱氨酸自甲硫氨酸中合成，因此也认为它们同必需氨基酸一样。人类及家畜的饮食(也称为食物和饲料)主要来自植物。在为动物和人类营养所必需的氨基酸中，有一些氨基酸如赖氨酸通常只以相对低的浓度存在于农作物中。因此，通常在谷物为主的饮食和其它饮食中加入合成的氨基酸作为补剂，以提高饮食的营养价值。饮食中的蛋白质不是营养等价的，其与不同蛋白质中氨基酸的组成相关。食用提供不适当数量的一种必需氨基酸的饮食导致负氮平衡，因为正常的蛋白质分解代谢继续进行，但由于必需氨基酸的相对缺乏而导致替代的新合成受限。这种情况甚至在蛋白质的总饮食摄入量是适量的时候也会发生。饮食蛋白可以用于合成组织蛋白质的程度，受限于相对于需要存在的最小量的必需氨基酸的含量。这是该蛋白质的限制性氨基酸。许多农作物含有非常低水平的赖氨酸。因此，植物中赖氨酸的含量是一个重要的农艺学特性，而且在过去通过传统培育，突变选择或通过遗传修饰，已经进行了各种尝试以提高植物中赖氨酸水平。调节氨基酸生物合成主要基于氨基酸终产物途径的关键酶的反馈抑制。提高植物中必需氨基酸的含量所遇到的问题是由于反馈抑制机制所致。必需氨基酸赖氨酸是与苏氨酸和甲硫氨酸一起，通过在细菌和高等植物中相似的复杂途径从天冬氨酸中合成的(附图说明图1)。天冬氨酸家族途径已经在大肠杆菌中，通过分离参与途径中的酶而加以了详细定性，所述酶随后也从高等植物中纯化(Bryan，J.K.(1980)，植物的生物化学(由B.J.Miflin编辑)，第5卷403-452，科学出版社，N.Y.；Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47583-606)。天冬氨酸家族氨基酸的合成速率，主要通过相应的氨基酸终产物途径中一些关键酶的活性的反馈抑制这一复杂过程调节的。与所有天冬氨酸家族氨基酸相同，这个途径中第一种酶活性，天冬氨酸激酶(AK)活性，是通过赖氨酸和苏氨酸反馈抑制的。另外，赖氨酸也抑制二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，DHPS)的活性，这种酶是在分支点后途径的第一种酶，导致赖氨酸合成。伴随着ATP水解，AK催化天冬氨酸磷酸化，形成3-天冬氨酰磷酸酯。在大肠杆菌和植物中已经鉴别了一些不同的AK同工酶，它们由赖氨酸或苏氨酸抑制。AK活性的产物，3-天冬氨酰磷酸酯盐，在接下来的酶促步骤中转换为3-天冬氨酸半醛(3-ASA)，其作为合成赖氨酸和苏氨酸的共同底物。二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)催化赖氨酸生物合成独特的第一个反应，即3-天冬氨酸半醛与丙酮酸缩合形成2，3-二氢吡啶二羧酸。在大肠杆菌中，这种酶是由dapA基因座编码的，并呈现由4个相同的亚单位组成的同型四聚体(Shedlarski，J.G.和Gilvarg，C.(1970)生物化学杂志，2451362-1373)。大肠杆菌基因dapA基因已经克隆并测序(Richaud，F.等，(1986)细菌学杂志166297-300)。在植物中，DHPS酶也表现为是一种与大肠杆菌酶相似的单酶。目前纯化的所有植物DHPS示出具有由赖氨酸强力抑制的活性。在植物中天冬氨酸家族途径的主要调节酶中，DHPS对其终产物反馈抑制最敏感(DHPS对赖氨酸的I50为10-50μM)。DHPS对赖氨酸抑制的敏感性是植物赖氨酸敏感性AKs(I50为100-700μM)的大约10倍，对赖氨酸抑制的敏感性是大肠杆菌DHPS(I50大约为1mM)的大约100倍(Yugari，Y和Gilvarg，C.(1962)生物化学生物物理学学报62612-614；Galili，G.(1995)植物学报7899-906)。一些迹象表明在植物中，DHPS是赖氨酸合成的主要限速酶。一些具有反馈不敏感AK同工酶的植物物种突变体，发现超量产生游离苏氨酸，但赖氨酸水平只微量提高(Bright，S.W.J.等(1982)自然299278-279；Cattoir-Reynaerts A.等(1983)生物化学生理学，Pflanzenl7881-90；Dotson，S.B.等(1990)植物学182546-552；Frankard，V.等(1992)，植物生理学991285-1293)。另一方面，一种反馈不敏感DHPS突变体烟草植物超量产生赖氨酸(Negrutiu，I.等(1984)，应用遗传学原理611-20；Shaver，J.M.等(1996)P.N.A.S.USA931962-1966)。表达来自大肠杆菌的反馈不敏感DHPS或AK的转基因植物报道了相似结果(Glassman，K.F.(1992)植物中氨基酸的生物合成和分子调节(由B.K.Singh等编辑)，217-228；Perl，A.等(1992)植物分子生物学19815-823；Shaul，O.和Galili，G.(1992a)植物杂志2203-209；Shaul，O.和Galili，G.(1992b)植物生理学1001157-1163)。表达大肠杆菌DHPS的转基因植物超量产生赖氨酸，而那些表达大肠杆菌AK的转基因植物超量产生苏氨酸，并呈现出赖氨酸水平只微量提高。欧洲专利申请No.429458揭示了一种提高植物中游离赖氨酸水平的方法，包括(a)将一个外源基因导入植物组织来源的细胞中，及(b)在细胞中表达此外源基因，其中此基因的第一个DNA序列编码DHPS，其通过内源性产生游离L-赖氨酸而对反馈抑制有抗性。所述外源基因可以包含附着于第一个DNA序列5，末端的第二个序列，其编码将DHPS定位于细胞叶绿体中的叶绿体转运肽(CTP)。所述植物产生的赖氨酸水平提高。欧洲专利申请No.EP93908395阐述了两个分离的DNA片段，包括一个编码对赖氨酸抑制不敏感的AK的片段，和另一个编码DHPS的片段，所述DHPS对赖氨酸抑制的敏感性比植物DHPS至少低20倍。据称在转化植物中，赖氨酸不敏感性AK导致产生高于正常的苏氨酸产量，DHPS导致产生高于正常的赖氨酸产量。当分别由棒杆菌dapA基因和突变的大肠杆菌lysC基因编码的反馈不敏感细菌DHPS和AK酶，一起在转基因canola和大豆种子中表达时，获得相同结果。在转基因种子中观测到游离赖氨酸水平提高几百倍，而在只表达反馈不敏感AK的转基因种子中观测到的苏氨酸超量积累却由与DHPS共表达而阻止(Falco，S.C.等(1995)，生物/技术13577-582)。美国专利申请No.577369l涉及四种嵌合基因，第一种编码细菌赖氨酸不敏感性天冬氨酸激酶(AK)，其可操纵地与植物叶绿体转运序列连接，第二种编码细菌赖氨酸不敏感性DHPS，其可操纵地与植物叶绿体转运序列连接，第三种编码富赖氨酸蛋白，第四种编码植物赖氨酸酮戊二酸还原酶，所有这些均可操纵地与植物特异性调节序列连接。所述转基因植物的种子比未转化的植物积累较本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码二氢吡啶二羧酸合酶（ＤＨＰＳ）或其功能片段的重组或分离的核酸，或其功能片段，其具有一导致至少一个单氨基酸残基被半胱氨酸残基置换的突变。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：奥斯卡弗雷德里克约瑟夫福斯特，英格丽德玛丽亚范德梅尔，尼古拉斯克莱门茨玛丽亚亨里克斯德，
申请(专利权)人：马铃薯及衍生产品合作销售生产阿韦贝公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]