用于动物细胞的表达载体制造技术

本发明专利技术涉及一种用于动物细胞的表达载体。特别是，本发明专利技术涉及的一种表达载体，ｐＭＳ载体，ｐＳＧ载体和ｐＭＳＧ载体，包括人β－珠蛋白５’ＭＡＲ的互补序列和／或胃泌素基因的转录终止位点。采用本发明专利技术的表达载体的表达体系可以成功地在各种动物细胞中生产重组蛋白，并且重组蛋白具有单一的结构和功能。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于动物细胞的表达载体，特别是，含有核基质着丝溢痕成分(在其后称作“MAR成分”)和胃泌素基因的转录终止位点的表达载体。然而，微生物表达体系的应用在某些方面是有限的。首先，尽管基因在微生物中被表达，但被表达的蛋白的结构和特性与其动物蛋白的并不同，因为微生物具有不同的表达蛋白的机制和蛋白的修饰机制，如糖基化，磷酸化和胺基化。因此，由微生物产生的重组蛋白几乎没有被修饰，或者它在蛋白质的修饰和结构的差别不足以影响蛋白产物的功能的蛋白质的产生中受限制。另外，使用微生物表达的重组蛋白时，被污染的微生物或毒素的清洗步骤是必要的。虽然动物细胞适用于动物蛋白的表达，但一般不使用采用动物细胞的表达体系，因为与微生物和动物细胞的表达体系相比，归因于重组蛋白的更低表达效率，采用动物细胞的表达体系会造成更高的生产成本。用于工业生产的动物细胞，它目前被用于包括CHO(中国鼠的卵巢)、BHK(幼鼠的肾)和骨髓瘤的表达体系，表达载体被导入到这种动物细胞并像在微生物中一样产生希望的外源蛋白。由于通常表达少量的外源蛋白，因此，通过各种方法修饰基因表达体系。例如，CHO的细胞毒株在含有氨甲蝶呤(其后称作“MTX”)的培养基中培养，氨甲蝶呤是DHFR(二氢叶酸还原酶)的抑制剂，以便获得存活依赖于MTX浓度的CHO的毒株，并且归因于基因复制数的增加更高地表达蛋白。通常，当外源基因在一种动物细胞中被表达时，外源基因被具有选择性标记物的载体共转染，在选择性培养基培养数小时后选择转化的细胞。然而，能够完成的高表达细胞的克隆的频率是低的。外源基因表达的低频率是由于在动物体系中外源基因的染色体的插入不像微生物那样。另外，尽管外源基因的插入过程是成功的，但不能期待外源基因的表达，原因是每个基因的插入位点不同而且基因表达要依靠插入位点。(Grindley等，1987.Trends Genet.3，16-22；Kucherlapati等，1984.Crit.Rev.Biochem.16，349-381；Palmiter等，1986.Annu.Rev.Genet.20，465499)。所以，尽管外源基因是稳定地完整的，其表达量也可能很低，因为在动物细胞中大部分的基因表达被邻近的核苷酸抑制(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Palmiter等，1986.AnnuRev.Genet.20，465-499)。为了保护外源基因的表达不受位置效应，在几个体系中应用核基质成分的可能性已有报道。可效仿的核成分包括绝缘体成分，核基质着丝溢痕(其后称作“MAR”)，支架结构着丝溢痕(其后称作“SAR”)。Kalos(Kalos等，1995 Mol.Cell.Biol.15，198-207)提出当阿朴脂蛋白BMAR组合最小的启动子反基因构建子时，外源基因被稳定的导入到宿主的染色体，这样转录物的表达量增加了200倍。和上述方法类似，已经报道小鸡溶解酶A MAR和β-干扰素SAR能够增加外源基因在脊椎动物细胞中的表达水平，而不用考虑染色体的插入位点(Eissenberg等，1991.Trends Genet.7，335-340；Klehr等，1991.Biochemistry30，1264-1270)。然而，并没有核实MAR和SAR能够增加在CHO细胞毒株中蛋白的产生，或者MAR和SAR适用于常规用途。当动物细胞基因被表达，mRNA的合成从启动子出现并在终止位点停止。蛋白的表达水平通常受转录终止的效率以及合成mRNA的稳定性的影响。包含在表达载体中的转录的终止位点控制聚腺苷酸化，并影响mRNA的稳定性。终止位点包括聚-A信号，分裂位点，终止位点，并且聚腺苷酸化信号是AATAAA，它已经被很好地研究。然而，发生聚腺苷酸化的分裂位点和基因转录通过RNA聚合酶II完成的终止位点是未知的。另外，尽管报道了除了三种临界区域外富含GU/U的区域控制mRNA的聚腺苷酸化，但其详细机理是未知的。通常用于动物细胞的表达载体包含SV40病毒和BGH(牛生长素)的聚-A信号，并且没有提出为了使用动物细胞表达载体而研发这种提高mRNA稳定性和表达水平的特别终止子。为了达到这些目的，本专利技术提供一种包括MAR(核基质着丝溢痕)成分或其启动子在5’-末端的互补序列的表达载体。同样，本专利技术提供了一种包括SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因转录终止位点组成的构建子的动物细胞的表达载体，其中的构建子具有序列SEQ ID No.3。同样，本专利技术提供了一种如序列SEQ ID No.8所示的载体pMSGKCCM10202，它包括人β-珠蛋白5’MAR(核基质着丝溢痕)的互补序列，其构建子由SV40病毒的聚-A信号和胃泌素基因的转录终止位点组成。同样，本专利技术提供了一种通过使用动物细胞的表达载体制备生物活性物质的方法，载体包括β-珠蛋白MAR成分，或者β-珠蛋白在启动子5’-末端的互补序列，包括如序列SEQ ID No.3所示的SV40病毒的聚-A(聚腺苷酸化)信号和胃泌素基因的转录终止位点的载体，和pMSG载体。图7显示在以pMS-β-gal或作为对照的pSV-β-gal转化的动物细胞中，表示β-Gal基因的复制数和β-Gal表达产量之间关系的曲线；图8显示在各种细胞系中pMS-β-gal载体的表达效价；图9显示在以pMS-β-gal载体或对照载体转化的细胞中依靠MTX浓度的外源蛋白的表达量；附图说明图10显示与对照组相比，scu-PA(单链尿激酶)被插入到pMS载体和pMC载体之后，scU-PA的表达效价；图11显示包括胃泌素基因的转录终止位点和SV40的聚-A信号的构建子；图12显示在包括含胃泌素基因转录终止位点和SV40聚-A信号的构建子的表达载体中β-Gal的表达量； 图13显示本专利技术的pMSG的结构；图14显示通过抗原-抗体反应证实的pMSG载体中TGF-βSRII的表达；图15显示TGF-βSRII表达量，它通过将TGF-βSRII基因克隆到pMSG载体，在CHO细胞中转染它们，在加入MTX的条件下培养而制备。专利技术人克服了当外源基因在动物细胞系中表达时特异位点效应引起的问题，并设计增加了基因的表达量的最佳表达载体。本专利技术的动物细胞表达载体包括合适的碱基序列，并进一步加入了常规的表达载体。合适的碱基序列包括核基质着丝溢痕(下文称作“MAR”)和支架结构着丝溢痕(下文称作“SAR”)，它们从插入位点的位置效应刺激如CHO(中国鼠卵巢)和BHK(幼鼠肾)的宿主外源基因的表达，增加了外源基因的表达量。MAR或SAR成分加入到启动子5’-末端，分析本专利技术的表达载体的效率。从细胞分离染色体DNA，接着通过PCR(聚合酶链式反应)和亚克隆在大肠杆菌E.coli中克隆染色体DNA，这样以致于获得含MAR和SAR成分的DNA。更优选的，MAR或SAR成分从由小鸡溶解酶5’MAR(Phi-Van，L.andStratling，W.H.，Biochemistry35，10735-10742(1996)，gene bank#X98408)，小鸡pia珠蛋白5’MAR(Krevskii，V.A.，Mikhailov，V.S.andRazin本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于动物细胞的表达载体，包括β－珠蛋白ＭＡＲ序列或其启动子的５’终止末端上的互补序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金锺默，金正燮，吴先模，尹在承，白光熙，郑守一，朴斗鸿，尹烨，
申请(专利权)人：材牧岩生明工学研究所，盼展生物技术实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]