一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途制造技术

本发明专利技术属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种出芽短梗霉及其在生产聚苹果酸中的用途。一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ‑6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明专利技术提供的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ‑6可利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液、麦芽糖浆作为碳源发酵生产聚苹果酸，相比较于利用葡萄糖作为碳源发酵生产聚苹果酸而言，原料成本更低，且不存在高浓度碳源对菌体生长产生抑制作用的问题。

A high yield polymalic acid sprout mildew and its use

【技术实现步骤摘要】
一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途
本专利技术属于微生物应用
，尤其涉及一种出芽短梗霉及其在生产聚苹果酸中的用途。
技术介绍
聚苹果酸[poly(β-L-malicacid)，PMLA]是以苹果酸为唯一单体通过α-羟基和β-羧基以酯键连接聚合而成的一种新型水溶性高分子化合物，具有良好的化学可塑性、生物降解性、生物相容性，在食品、医药、农业等领域具有广阔的应用前景。1969年聚苹果酸首次在圆弧青霉(Penicilliumcyclopium)中被发现，国外研究人员随后对聚苹果酸的制备方法、性质及其用途等进行了广泛研究，国内直到2000年左右才陆续有相关研究报道。目前，聚苹果酸主要是利用微生物发酵法制备，发酵所用菌株主要包括多头绒泡菌(Physarumpolycephalum)和出芽短梗霉(Aureobasiumpullulan)。其中，多头绒泡菌合成的聚苹果酸分子量较高(50-300kDa)，但是产量较低，一般在2-3g/L；出芽短梗霉合成的聚苹果酸分子量较低(4-11kDa)，但是产量较高，一般在10-47g/L。相对于高分子量聚苹果酸，低分子量聚苹果酸具有更好的水溶性、生物相容性和生物降解性，其在食品、医药等领域更具应用潜力。因此，从发酵产量和应用潜力来看，出芽短梗霉更适合用于发酵生产聚苹果酸。菌种是发酵工业的核心，因此国内外研究人员在高产聚苹果酸的出芽短梗霉菌株选育方面做了大量工作。如，天津北洋百川生物技术有限公司的乔长晟等人(CN101979499)利用紫外线诱变技术选育获得一株出芽短梗霉TKPM00006，在优化条件下以葡萄糖(12％，w/v)为碳源，25℃摇瓶分批发酵7-12天，聚苹果酸产量为18.4±1.3g/L；浙江大学徐志南等人(CN102220248)从植物叶片表面筛选获得一株不产生黑色素的出芽短梗霉ZD-3D，在添加发酵促进剂富马酸钠的条件下，以葡萄糖(12％，w/v)为碳源，25℃摇瓶分批发酵168h，聚苹果酸产量为62.27g/L；西南大学邹祥等人(CN102827778)选育获得一株出芽短梗霉FMT1801，以工业副产物糖蜜(12％，w/v)为碳源，25℃发酵罐分批发酵96h，聚苹果酸产量为34.4g/L。此外，上述三种出芽短梗霉的发酵培养基中均需要添加一定量的玉米浆或玉米浸出液作为生长因子促进菌株的生长和聚苹果酸的合成。上述三篇文献中利用选育获得的出芽短梗霉菌株在发酵生产聚苹果酸过程中存在如下不足之处：(一)高浓度葡萄糖作为碳源，一方面原料成本较高，另一方面高浓度葡萄糖对菌体生长存在底物抑制作用进而限制聚苹果酸产量的提高；而以糖蜜作为碳源时，由于糖蜜本身颜色较深、杂质含量较多，尽管原料成本有所下降，但会增加聚苹果酸提取纯化和发酵废液处理的费用。(二)聚苹果酸产量仍较低，尽管出芽短梗霉ZD-3D合成聚苹果酸最高产量可达到62.27g/L，但培养基中需要添加富马酸钠作为发酵促进剂，增加了发酵原料成本。(三)上述三种出芽短梗霉的发酵培养基中均需要添加一定量的玉米浆或玉米浸出液，一方面增加了发酵原料成本，另一方面由于玉米浆或玉米浸出液成分复杂、质量难以控制，对发酵过程的影响存在不确定性。(四)上述三种出芽短梗霉的发酵温度均为25℃，而微生物发酵是一个放热过程，因此较低的发酵温度需要提供大量的冷却水来维持，从而提高发酵设备运行成本。公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
技术实现思路
鉴于上述菌种和生产技术的不足，本专利技术提供一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6，并利用其发酵生产聚苹果酸。该出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6可以利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液和麦芽糖浆作为碳源，在不添加发酵促进剂(如富马酸钠)和生长因子(如玉米浆)的条件下，30℃分批发酵获得60g/L以上的聚苹果酸。该生产方法具有发酵原料成本低、工艺简单、产物易提取纯化的优点，极具工业生产潜力。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6，保藏编号为CCTCCNO：M2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。本专利技术还提供了出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6发酵生产聚苹果酸的方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，28-30℃恒温培养2-3天；(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有50-100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养36-48h得到种子液；(3)发酵培养：将种子液按照8-10％接种量接入装有30-40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养8-9天；(4)聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80％乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。作为优选，步骤(2)中所述的液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖80-100g/L，硝酸钠2-4g/L，KCl0.4-0.6g/L，KH2PO40.05-0.2g/L，MgSO4·7H2O0.1-0.3g/L，ZnSO4·7H2O0.05-0.2g/L，CaCO315-30g/L。作为优选，步骤(3)中所述液体发酵培养基的浓度组分如下：碳源120-160g/L，硝酸钠2-4g/L，KCl0.4-0.6g/L，KH2PO40.05-0.2g/L，MgSO4·7H2O0.2-0.6g/L，ZnSO4·7H2O0.05-0.2g/L，CaCO330-50g/L。作为优选，所述的碳源为木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液和麦芽糖浆中的至少一种。作为优选，所述的淀粉糖化液是利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉或可溶性淀粉经过α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取。作为优选，所述麦芽糖浆为市售麦芽糖浆。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术提供的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6可利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液和麦芽糖浆作为碳源发酵生产聚苹果酸，相比较于利用葡萄糖作为碳源发酵生产聚苹果酸而言，原料成本更低，且不存在高浓度碳源对菌体生长产生抑制作用的问题。此外，其液体发酵培养基中不需要添加发酵促进剂(如富马酸钠)和生长因子(如玉米浆)，菌株营养要求简单、发酵成本低廉，可满足工业化大规模生产，具备显著的经济效益。(2)本专利技术的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其特征在于，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ‑6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其特征在于，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6，保藏编号为CCTCCNO：M2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。2.根据权利要求1所述的出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，28-30℃恒温培养2-3天；(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有50-100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养36-48h得到种子液；(3)发酵培养：将种子液按照8-10％接种量接入装有30-40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养8-9天；(4)聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80％乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。3.根据权利要求2所述的出芽短梗霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾伟，梁智群，陈桂光，张斌，李梦璇，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45