防治灰霉病生防菌间型假丝酵母C410及其悬浮剂和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种防治灰霉病生防菌间型假丝酵母C410及其悬浮剂和应用；该菌株命名为间型假丝酵母C410Candida intermedia C410，其保藏编号为CCTCC NO：M2017036。间型假丝酵母C410菌株抑制灰葡萄孢菌分生孢子萌发和菌丝生长，减轻番茄叶片和果实感染灰霉病。本发明专利技术的间型假丝酵母C410菌株的细胞悬浮液对大棚番茄灰霉病的抑制作用。本发明专利技术的间型假丝酵母C410菌株的细胞悬浮液在YPDA平板、番茄叶片和番茄果实上对灰霉病菌菌丝生长、分生孢子萌发和对番茄叶片和果实侵染的抑制作用。

Among the bacteria type Candida C410 and suspending agent and application of birth control of Botrytis cinerea

The invention discloses a bacterium type between Candida C410 and suspending agent and application control of Botrytis cinerea; the strains named type between Candida C410Candida intermedia C410, whose preservation number is CCTCC NO:M2017036. The C410 strain of intertype Candida inhibits the germination of conidia and mycelial growth of the vitis cinerea, and reduces the infection of gray mould in tomato leaves and fruits. The inhibitory effect of the cell suspension of the intertype Candida C410 strain on the greenhouse tomato Botrytis cinerea. The cell suspension of the Candida tropicalis C410 strain inhibits the growth of mycelia, conidial germination and infection of tomato leaves and fruits on YPDA plates, tomato leaves and tomato fruits.

【技术实现步骤摘要】
防治灰霉病生防菌间型假丝酵母C410及其悬浮剂和应用
本专利技术涉及生物农药
，具体地指一株防治灰霉病生防菌间型假丝酵母C410及其悬浮剂和应用。
技术介绍
由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的果蔬灰霉病是世界性分布的重要病害。这种病菌对一些重要的蔬菜和水果如番茄、黄瓜、葡萄、草莓等果蔬的产量和品质构成了极大威胁，一般可使果蔬减产20％以上，严重时甚至绝产。近年来，随着果蔬设施栽培面积迅速扩大，而大棚内小气候环境十分有利于灰霉病的发生发展，导致茄果类、瓜类、葱韭类、浆果类果蔬的减产，造成很大的经济损失。灰霉病已成为限制果蔬产量和品质的重要因素。由于灰葡萄孢菌是一个死体营养型病原菌，寄主范围广，生产上又缺乏抗病品种，目前防治灰霉病的主要手段是喷施化学农药。但是化学农药的长期使用导致灰霉病产生抗药性，以及农药在果蔬和环境中的残留也造成了果蔬和环境的农药污染。近年来，生物防治已成为灰霉病的一种重要防治措施，因为其对灰霉病防效显著且对环境安全，同时不会诱导病菌产生抗性，对人畜无毒，应用前景广泛，是近年来研究的重点。利用酵母菌来防治果蔬病害越来越受人们的重视，这是因为酵母菌与其它生防微生物相比，具有很多优点：第一、酵母菌适应力强定殖快，对环境的要求不高，具有较强的抗逆能力；第二、酵母菌一般不产生抗菌素，可以避免病原菌对抗菌素产生抗性，也可以避免抗菌素可能对人体产生潜在的不利影响；第三、酵母菌容易被大众接受，已在食品和酿造工业中有广泛的应用，是人类直接食用最多的一类微生物。但是，目前没有生物防治灰霉病的报道，
技术实现思路
本专利技术针对灰霉病生防菌间型假丝酵母制剂的空白，提供了一株防治灰霉病生防菌间型假丝酵母C410及其悬浮剂和应用。为实现上述目的，本专利技术保护的一株间型假丝酵母C410菌株，该菌株命名为间型假丝酵母C410CandidaintermediaC410，其保藏编号为CCTCCNO：M2017036。该菌株分离自湖北武汉地区健康草莓叶片。C410菌株通过形态学观察和分子生物学鉴定，将该菌株鉴定为间型假丝酵母(Candidaintermedia)。因此将菌株C410定名为间型假丝酵母(Candidaintermedia)C410。该菌种已于2017年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；保藏登记号为CCTCCM2017036；保藏地点为：中国、武汉、武汉大学。进一步地，所述间型假丝酵母C410菌株形成的菌落呈卵圆形，乳白色，表面有磨砂状粗糙感，质地粘稠，具有芳香味，直径0.2～0.5cm，前期菌落边缘较整齐，后期菌落边缘形成发散性树枝状分枝的丝状边缘。所述间型假丝酵母C410菌株在显微镜下，菌株以出芽生殖方式形成假菌丝；单细胞为卵圆形或椭圆形，其长×宽为3～5μm×2～4μm，细胞为多边芽殖，未见有子囊孢子和掷孢子产生。半厌氧条件下，该酵母C410菌株能够发酵D-葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖、果糖和蔗糖，但不能发酵乳糖和淀粉。有氧环境下，该酵母菌C410可以同化D-葡萄糖、麦芽糖、D-半乳糖、乳糖、D-木糖、柠檬酸、蔗糖、果糖、海藻糖、L-阿拉伯糖、甘油、甘露醇、山梨醇和乙醇，不能同化D-阿拉伯糖、淀粉、乳酸、甲醇和肌醇。在氮源同化测定试验中，该酵母C410菌株能够同化L-赖氨酸和硫酸铵，但不能同化硝酸盐、亚硝酸盐及肌酸。该酵母C410菌株能产生芳香的酯类物质，可以耐较高渗透压，代谢不产生酸和淀粉，无法水解尿素，不能在42℃生长。本专利技术还保护了一种间型假丝酵母C410菌株防治灰霉病中的应用，所述间型假丝酵母C410菌株抑制灰葡萄孢菌分生孢子萌发和菌丝生长，减轻番茄叶片和果实感染灰霉病。本专利技术还保护了一种间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液，所述C410菌株细胞悬浮液为含有间型假丝酵母C410细胞的磷酸缓冲液，其中，所述磷酸缓冲液中间型假丝酵母C410细胞数目为2～3×109个/mL。进一步地，所述C410菌株细胞悬浮液中还含有海藻糖和抗坏血酸VC，其中，C410菌株细胞悬浮液中海藻糖和抗坏血酸VC含量分别为3～5％和0～0.02％。本专利技术提供了一种间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液的制备方法，包括以下步骤：1)将间型假丝酵母C410菌株的菌液划线接种在YPDA培养基上培养，得到间型假丝酵母C410菌落；2)将步骤1)得到的间型假丝酵母C410菌落挑取再接种到YPD液体培养基上培养，得到C410种子发酵液，待用；3)将步骤2)得到的C410种子发酵液滴加至YPDA平板上，用涂布器涂匀吹干后培养；4)向步骤3)中YPDA培养皿上加入无菌水，刮洗菌落表面的酵母细胞，得到酵母细胞液，离心浓缩，弃上清，并将酵母细胞重新悬浮于磷酸缓冲液PPB中清洗，然后再次离心浓缩，弃上清，并将酵母细胞重悬浮于磷酸缓冲液中，再加入海藻糖和抗坏血酸VC，即得到间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液。作为优选方案，所述间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液中间型假丝酵母C410细胞数目为2～3×109个/mL；C410菌株细胞悬浮液中海藻糖和抗坏血酸VC含量分别为3～5％和0～0.02％。作为优选方案，所述步骤1)中，培养条件为在温度为20～22℃，黑暗条件下培养72～75h；所述步骤2)中，培养条件为在温度为20～22℃，150～180r/min的条件下振荡、黑暗培养72～75h；所述步骤3)中，培养条件为在温度为20～22℃，黑暗条件下培养72～75h；所述步骤4)中，两次离心浓缩的条件均为在温度为4℃，8000～9000r/min的条件下离心10～12min。其中，YPDA培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，琼脂20g,补充蒸馏水至1000mL；YPD培养基的配方：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取浸粉10g，补充蒸馏水至1000mL；YPDA培养基和YPD培养基均需121℃灭菌20min后使用。PPB磷酸缓冲液的配方：1MK2HPO427.8ml,1MKH2PO472.2ml，混合均匀后稀释至50mM。本专利技术还保护了上述间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液在抑制灰葡萄孢分生孢子萌发中的应用。本专利技术还保护了上述间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液在防治番茄灰霉病的药剂中应用。其通过对番茄叶片灰霉病和番茄果实灰霉病进行抑制，从而起到防治的作用。本专利技术的有益效果在于：1)本专利技术的间型假丝酵母C410菌株的细胞悬浮液对大棚番茄灰霉病的抑制作用。2)本专利技术的间型假丝酵母C410菌株的细胞悬浮液在YPDA平板、番茄叶片和番茄果实上对灰霉病菌菌丝生长、分生孢子萌发和对番茄叶片和果实侵染的抑制作用。附图说明图1为间型假丝酵母C410菌株的菌落形态(PDA，20℃,3d)；图中，A：菌落形态；B：菌落边缘形态；C：假菌丝；D：菌细胞形态及其芽殖；图2为间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液对灰葡萄孢分生孢子萌发的抑制图；图中，图2A为不同浓度间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液处理后灰葡萄孢分生孢子萌发后第3天形成的菌落直径；图2B为不同浓度间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液处理后灰葡萄孢分生孢子萌发后第5天的菌落直径；图2C为不同浓度间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液处理后灰葡萄孢分生孢子萌发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株间型假丝酵母C410菌株，其特征在于：该菌株命名为间型假丝酵母C410Candida intermedia C410，其保藏编号为CCTCC NO：M2017036。

【技术特征摘要】
1.一株间型假丝酵母C410菌株，其特征在于：该菌株命名为间型假丝酵母C410CandidaintermediaC410，其保藏编号为CCTCCNO：M2017036。2.根据权利要求1所述间型假丝酵母C410菌株，其特征在于：所述间型假丝酵母C410菌株形成的菌落呈卵圆形，乳白色，表面有磨砂状粗糙感，质地粘稠，具有芳香味，直径0.2～0.5cm，前期菌落边缘较整齐，后期菌落边缘形成发散性树枝状分枝的丝状边缘。3.根据权利要求1或2所述间型假丝酵母C410菌株，其特征在于：所述间型假丝酵母C410菌株在显微镜下，菌株以出芽生殖方式形成假菌丝；单细胞为卵圆形或椭圆形，其长×宽为3～5μm×2～4μm，细胞为多边芽殖，未见有子囊孢子和掷孢子产生。4.一种间型假丝酵母C410菌株防治灰霉病中的应用，其特征在在于：所述间型假丝酵母C410菌株抑制灰葡萄孢菌分生孢子萌发和菌丝生长，减轻番茄叶片和果实感染灰霉病。5.一种间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液，其特征在于：所述C410菌株细胞悬浮液为含有间型假丝酵母C410细胞的磷酸缓冲液，其中，所述磷酸缓冲液中间型假丝酵母C410细胞数目为2～3×109个/mL。6.根据权利要求5所述间型假丝酵母C410菌株细胞悬浮液，其特征在于：所述C410菌株细胞悬浮液中还含有海藻糖和抗坏血酸VC，其中，C410...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨龙，黄蓉，李若晨，李国庆，张静，吴明德，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42