V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途制造技术

本发明专利技术涉及生物制剂领域，公开了一种能结合金黄色葡萄球菌的V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途。本发明专利技术提供的新用途是V12CBD蛋白及其编码基因在制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物中的应用，V12CBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，V12CBD蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验表明，V12CBD与金黄色葡萄球菌结合后能抑制细菌在上皮细胞的粘附和入侵，增强金黄色葡萄球菌对巨噬细胞的敏感性；V12CBD能活化巨噬细胞，增强机体的免疫功能；预防性注射V12CBD以及包含有V12CBD的融合蛋白质能显著提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率。因此，V12CBD能单独或者作为添加剂与不同形式的试剂和溶液配伍，用于葡萄球菌的治疗与预防性治疗，具有广泛的应用前景。

A new use of V12CBD protein and its encoding genes

The invention relates to the field of biological preparation, and discloses a new use of V12CBD protein and its encoding gene that can bind Staphylococcus aureus. The invention provides a novel application of V12CBD protein and its encoding gene in preparation for treatment and prevention of drug use of Staphylococcus aureus infection in the amino acid sequence of V12CBD proteins such as SEQ ID NO.2, nucleotide sequence of the gene encoding V12CBD protein as shown in SEQ ID NO.1. Experimental results show that the combination of V12CBD and Staphylococcus aureus can inhibit bacterial adhesion and invasion of epithelial cells, enhance the sensitivity of Staphylococcus aureus to macrophages; V12CBD can activate macrophages, enhance immune function; prevent injection of V12CBD and V12CBD proteins containing fusion can significantly improve the survival rate of mice with Staphylococcus aureus infection. Therefore, V12CBD can be used alone or as an additive with different forms of reagents and solutions for staphylococcal treatment and preventive treatment, which has wide application prospects.

【技术实现步骤摘要】
V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途
本专利技术涉及生物制剂领域，具体涉及肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途。
技术介绍
葡萄球菌是一类球形的革兰氏阳性细菌，能引起人和动物的很多疾病，同时也是医院感染常见的病原菌之一。由于葡萄球菌的广泛耐药性，尤其是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现和世界范围的传播，金黄色葡萄球菌引起的感染已成为院内和社区获得性感染中的主要致病菌，致死率较高，危害巨大。由于新型抗生素开发的缓慢以及葡萄球菌疫苗的缺乏，针对葡萄球菌发展新型抗菌药物具有非常重要的意义。金黄色葡萄球菌在上皮细胞的粘附和入侵是其发起感染的第一步，这是在金黄色葡萄球菌表面特异蛋白与宿主上皮细胞之间的相互作用下发生的。巨噬细胞作为机体抵御病原体入侵的第一道防线，会对入侵的病原体进行吞噬和杀灭。但是，金黄色葡萄球菌由于具有特殊的肽聚糖结构以及菌体表面修饰，如荚膜多糖，壁磷壁酸等，能够逃逸巨噬细胞的免疫清除。因此，金黄色葡萄球菌的免疫逃逸是其感染难治愈和高致死率的帮凶。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶，用于水解宿主细菌的细胞壁释放子代噬菌体。裂解酶通常具有模块化的结构，即包括N-端的催化功能域(CD)和C-端的细胞结合功能域(CBD)。这两个功能域相对独立，具有比较明确的功能。之前的研究表明，CD功能域主要体现为肽聚糖水解活性，而CBD功能域则具有与特定把细菌特异性识别的功能。但只具有CBD结合功能的蛋白质对细菌生长和感染的影响迄今为止未见任何报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，所述V12CBD蛋白应用于制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物，所述V12CBD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述V12CBD蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述V12CBD蛋白通过提高宿主巨噬细胞杀菌能力来预防葡萄球菌感染。进一步地，所述V12CBD蛋白通过结合葡萄球菌来降低细菌毒力来治疗葡萄球菌感染。进一步地，所述V12CBD蛋白通过与噬菌体裂解酶催化域、抗菌肽和细菌抗原中的任一种或多种氨基酸片段融合成新的蛋白质来预防葡萄球菌感染。本专利技术另一方面公开了V12CBD蛋白的制备方法。所述V12CBD蛋白可利用常规的基因工程的制备方法获得。例如：通过PCR扩增相应的编码基因序列，经克隆筛选和测序鉴定正确后，利用pET28a(+)质粒构建原核表达载体，将鉴定正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得阳性转化子，再以IPTG诱导表达，对以胞内可溶性表达的V12CBD蛋白进行亲和层析纯化，即得。本专利技术首次公开了V12CBD蛋白用于制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物的新用途。实验表明，所述V12CBD蛋白与金黄色葡萄球菌结合后能抑制细菌与上皮细胞的粘附和入侵，能提高细菌对巨噬细胞的敏感性；V12CBD蛋白还能活化巨噬细胞，增强其对金黄色葡萄球菌的吞噬和杀灭能力；V12CBD蛋白不仅能用于金黄色葡萄球菌感染的治疗，还能用于预防金黄色葡萄球菌感染。因此，V12CBD能单独或者作为添加剂与不同形式的试剂和溶液配伍，用于葡萄球菌的控制与预防性治疗。附图说明图1为V12CBD抑制金黄色葡萄球菌与上皮细胞粘附结果示意图。图2为V12CBD抑制金黄色葡萄球菌入侵上皮细胞的结果示意图。图3为V12CBD提高金黄色葡萄球菌对巨噬细胞敏感性的结果示意图。图4为V12CBD降低金黄色葡萄球菌体内毒力的结果示意图。图5为V12CBD增强巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的结果示意图。图6为V12CBD增强巨噬细胞杀灭金黄色葡萄球菌的结果示意图。图7为V12CBD诱导巨噬细胞细胞因子分泌的结果示意图。图8为不同浓度的V12CBD细胞毒性的结果示意图。图9为V12CBD用于金黄色葡萄球菌感染小鼠治疗的结果示意图。图10为V12CBD预防性治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠的结果示意图。图11为融合有V12CBD片段的蛋白质Ply187N-V12C预防性治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠结果示意图。具体实施方式以下通过实例来具体说明本专利技术的某些实施例，但不应解释为限制本专利技术的范围。对本专利技术公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本专利技术的的精神和范围之内。实施例1、V12CBD的克隆表达1.在上海生工生物工程有限公司全序列合成裂解酶PlyV12基因DNA序列。以合成的序列为模板，以下两条序列为引物，通过常规PCR扩增得到V12CBD基因序列，并通过常规分子克隆方法将目标片段连入pET28a(+)表达载体后，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。引物设计如下：Upper：5-GACGGAATTCTTAAACGGTGGAAGCACTCCTCCAAAAC-3EcoRIDown：5-TCGCCTCGAGTTACTTAAATGTACCCCATGCTTCCTTACC-3XhoI2.V12CBD的表达纯化。将表达菌株BL21(DE3)/pET-V12CBD接种到500mL的培养基中37℃震荡培养，待OD600长到0.6～0.8时，添加IPTG至0.2mM，然后将培养基转入16℃诱导表达16～20小时。培养结束后，收集菌体并超声破碎，破碎液10000g离心30min，取上清过0.22μm滤膜，然后按照常规方法通过his标签亲和纯化，收集250mM洗脱液并透析于PBS缓冲液中，过滤后置于-20℃备用。实施案例2、V12CBD抑制金黄色葡萄球菌与上皮细胞粘附结果的验证将金黄色葡萄球菌N315与不同浓度(0μg/ml、25μg/ml、100μg/ml)的V12CBD蛋白在37℃孵育1h，用PBS洗涤3次后将金黄色葡萄球菌加到铺有上皮细胞A549的孔板中，37℃共培养1h。用PBS洗涤3次后，裂解细胞，涂平板计算每孔细菌数，所得到的结果如图1所示。结果显示，随着V12CBD蛋白浓度的增加，与V12CBD孵育后的金黄色葡萄球菌粘附到上皮细胞上的数量明显减少，表明V12CBD蛋白使金黄色葡萄球菌与上皮细胞粘附能力受到抑制。实施案例3、V12CBD抑制金黄色葡萄球菌入侵上皮细胞结果的验证将金黄色葡萄球菌N315与不同浓度(0μg/ml、25μg/ml、100μg/ml)的V12CBD蛋白在37℃孵育1h，用PBS洗涤3次后将金黄色葡萄球菌加到铺有上皮细胞A549的孔板中，37℃共培养1h。PBS洗涤3次后，加入1mg/ml的庆大霉素处理2h以杀灭粘附在细胞表面的细菌。用PBS洗涤3次后裂解细胞，涂平板计算每孔细菌数，所得到的结果见如图2所示。结果显示，随着V12CBD蛋白浓度的增加，与V12CBD孵育后的金黄色葡萄球菌入侵到上皮细胞里面的数量明显减少，表明V12CBD蛋白使金黄色葡萄球菌N315入侵上皮细胞能力受到抑制。实施例4、V12CBD提高金黄色葡萄球菌对巨噬细胞敏感性结果的验证将不同浓度的V12CBD(0μg/ml、25μg/ml、50μg/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白应用于制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物，所述V12CBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白应用于制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物，所述V12CBD蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：危宏平，杨航，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42