本发明专利技术涉及重组Glut1腺相关病毒载体(rAAV)构建体和用于恢复Glut1缺陷型哺乳动物中的Glut1表达的相关方法。在某些实施方案中，所述rAAV还包含鸡β‑肌动蛋白启动子，其中所述rAAV能够穿过血脑屏障(BBB)。在某些实施方案中，本发明专利技术涉及一种组合物，所述组合物包含本文所述的任何重组AAV。在某些实施方案中，本发明专利技术涉及一种包括容器壳体的试剂盒，所述容器壳体包含本文所述的组合物。在某些实施方案中，本发明专利技术涉及恢复受试者的BBB中的Glut1转运的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何重组AAV载体。在某些实施方案中，本发明专利技术涉及一种治疗有需要的受试者中的Glut1缺陷综合征的方法。
Recombinant GLUT1 adeno-associated virus vector construction and related methods for restoring GLUT1 expression
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组GLUT1腺相关病毒载体构建体以及用于恢复GLUT1表达的相关方法相关申请的交叉引用本申请要求于2015年3月10日提交的美国临时专利申请序列号62/130,899的优先权，其通过引用整体并入本文。政府支持的声明本专利技术是在美国国家卫生研究院授予的拨款号R01NS057482下借助政府资助进行的。政府可以具有本专利技术的某些权利。序列表本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且据此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本于2016年3月4日创建，名称为01001～003887～WO0_SL.txt，并且大小为189,953字节。专利
本专利技术涉及重组Glut1腺相关病毒载体(AAV)构建体和用于恢复Glut1缺陷型哺乳动物中的Glut1表达的相关方法。背景葡萄糖是哺乳动物脑的主要能量来源。葡萄糖转运蛋白1(Glut1)，也称为溶质载体家族2，是血脑屏障(BBB)中表达的主要葡萄糖转运蛋白，负责葡萄糖进入脑，并且是促进葡萄糖转运蛋白家族的第一个鉴定成员(SLC2A)。编码Glut1蛋白的人基因SLC2A1已定位于染色体1的短臂(1p34.2)并且长度为35kb，含有编码492个氨基酸(SEQIDNO:79)的蛋白质的10个外显子。该蛋白质在包括人、大鼠、小鼠和猪在内的不同物种之间是高度保守的。编码mGlut1蛋白的小鼠Slc2a1基因定位于染色体4，并且与人SLC2A1具有非常相似的基因结构(小鼠基因组信息学(MouseGenomeInformatics))(492个氨基酸的mGlut1序列是SEQIDNO:78)。小鼠Slc2a1cDNA(NM011400)与人SLC2A1cDNA是>97％相同的。(参见，MuecklerM等人,1985；Veggiotti,P等人,2013；Seidner等人,1998)。Glut1缺陷综合征(Glut1DS，OMIM606777)是由SLC2A1基因的单倍体不足(haplo-insufficiency)引起的罕见但令人虚弱的儿童神经病症。Glut1缺陷综合征是常染色体显性病症。最突出的患者表型包括婴儿癫痫发作、获得性小头、发育迟缓和脑脊液糖分过少(DeVivoD.C.等人1991)。疾病的当前治疗包括使用生酮饮食，因为酮体形成脑中神经元的替代能量来源。然而，饮食涉及摄取大量的油，并且据报道对神经行为症状只有适度的影响。持续需要更好的治疗，特别是用于基因疗法以恢复患者中的Glut1表达。专利技术概述在某些实施方案中，本专利技术涉及重组腺相关载体(rAAV)，所述重组腺相关载体包含核酸序列，所述核酸序列包含编码Glut1的转基因。在某些实施方案中，Glut1包含SEQIDNO:78或79。在某些实施方案中，rAAV还包含鸡β-肌动蛋白启动子，其中所述rAAV能够穿过血脑屏障(BBB)。在某些实施方案中，转基因能够在作为脑微血管系统衬里的内皮细胞中表达。在某些实施方案中，鸡β-肌动蛋白启动子选自由SEQIDNO:31、38、45、54、62和70组成的组。在某些实施方案中，rAAV是AAV8或AAV9。在某些实施方案中，rAAV还包含选自由SEQIDNO:48、56、59、64和73组成的组的miRNA元件。在某些实施方案中，rAAV还包含在所述miRNA元件侧翼的反向末端重复(ITR)。在某些实施方案中，本专利技术涉及组合物，其包含本文所述的任何重组AAV。在某些实施方案中，组合物还包含药用载体。在某些实施方案中，本专利技术涉及试剂盒，其包括容器壳体，所述容器壳体包含本文所述的组合物。在某些实施方案中，容器是注射器。在某些实施方案中，本专利技术涉及恢复受试者的血脑屏障(BBB)中的Glut1转运的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何重组AAV载体，其能够穿过BBB并且还能够在作为脑微血管系统衬里的内皮细胞中表达。在某些实施方案中，本专利技术涉及治疗有需要的受试者中的Glut1缺陷综合征的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何重组AAV载体，其能够穿过BBB并且还能够在作为脑微血管系统衬里的内皮细胞中表达。在某些实施方案中，本专利技术涉及在受试者中缓解至少一种与Glut1缺陷综合征相关的症状的方法，所述症状选自由脑脊液糖分过少、获得性小头、共济失调性和张力障碍性运动功能障碍组成的组，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的任何重组AAV载体，其能够穿过BBB并且还能够在作为脑微血管系统衬里的内皮细胞中表达。在某些方面，本专利技术的实施方案涉及用于治疗以SLC2A1基因缺陷或单倍体不足为特征的受试者中的Glut1DS的方法。该方法可以包括向受试者施用有效量的重组腺相关病毒，所述病毒携带在启动子序列的控制下编码正常/野生型Glut1蛋白的核酸序列(即转基因)，所述启动子序列在期望的细胞中表达Glut1产物。在某些实施方案中，启动子序列提供了BBB细胞中Glut1产物的表达。在某些实施方案中，表达是在作为脑微血管系统衬里的内皮细胞中。在某些实施方案中，转基因基因的表达对细胞提供了在受试者中恢复或维持期望的Glut1水平所必需的产物。在另一个实施方案中，本专利技术提供了用于治疗Glut1DS的组合物。此类组合物可以用载体和适于注射的其它组分配制。本专利技术的其它方面和优点在对其优选实施方案的以下详细描述中进一步描述。附图简述图1A-D是(10种)Glut1编码构建体的质粒图。图1A显示携带Glut1和EGFP报道基因以及2A编码序列的两种EGFP-2A-Glut1构建体。图1B显示了两种Glut1-2A-EGFP构建体。图1C显示两种天然Glut1构建体。图1D显示了携带miRNA-122结合位点(Mir-122BS)的四种构建体，所述miRNA-122结合位点用来选择性地关闭肝组织中Glut1的表达。图2A-C是显示在体外CHO细胞测定中AAV9-hGlut1-eGFP(SEQIDNO:80)构建体的表达和Glut1功能的印迹和图。图2A显示了证明AAV9-hGlut1-eGFP构建体的表达的蛋白质印迹。图2B是显示用AAV9-hGlut1-eGFP构建体转染的CHO细胞对葡萄糖的摄取增强的图；证明其在功能测定中的能力。图2C显示转染入CHO细胞中后构建体的GFP荧光。图3A-B是显示在将鼠slc2a1基因重新导入Glut1DS小鼠后增强的运动表现的图。图3A是显示在AAV9-mGlut1(SEQIDNO:35)处理的突变体小鼠中改善的转杆(rotarod)表现的图。图3B是显示在处理的突变体小鼠中恢复mGlut1后改善的垂直杆爬行的图。图4A-B是显示AAV9-mGlut1(SEQIDNO:35)处理的小鼠中Glut1的组织特异性表达增强的图。图4A是显示经处理的突变体和相关对照中相对的slc2a1基因表达的图。图4B是显示在野生型Glut1+/+小鼠中作为表达百分比的Glut1表达的图。图5A-D是显示AAV9-mGlut1处理的突变体小鼠中Glut1蛋白和CSF葡萄糖水平升高的印迹和图；证明了恢复Glut1减轻Glut1DS模型小鼠的脑脊液糖分过少。图5A是处理的Glut1DS突变体小鼠和相关对照的脑组织中Glut1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种包含核酸序列的重组腺相关载体(rAAV)，所述核酸序列包含编码Glut1的转基因。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.10 US 62/130,8991.一种包含核酸序列的重组腺相关载体(rAAV)，所述核酸序列包含编码Glut1的转基因。2.如权利要求1所述的重组AAV，其还包含鸡β-肌动蛋白启动子并且其中所述rAAV能够穿过血脑屏障(BBB)。3.如权利要求2所述的重组AAV，其中所述转基因能够在作为脑微血管系统衬里的内皮细胞中表达。4.如权利要求2所述的重组AAV，其中所述鸡β-肌动蛋白启动子选自由SEQIDNO:31、38、45、54、62和70组成的组。5.如权利要求1所述的重组AAV，其中所述AAV是AAV8或AAV9。6.如权利要求1所述的重组AAV，其中所述Glut1包含SEQIDNO:78或79。7.如权利要求1所述的重组AAV，其还包含选自由SEQIDNO:48、56、59、64和73组成的组的miRNA元件。8.如权利要求1所述的重组AAV，其中所述重组载体还包含在所述miRNA元件侧翼的反向末端重复(ITR)。9.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的重组AAV。10.如权利要求9所述的组合物，其还包含药用载体。11.一种包括容器壳体的试剂盒，所述容器壳体包含如权利要求9所述的组合物。12.如权利要求11所述的试剂盒，其中所述容器是注射器。13.一种恢复受试者的血脑屏障(BBB)中的Glut1转运的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1所述的重组AA...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·德威伍，U·莫纳尼，G·高，K·恩格尔斯塔，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，马萨诸塞大学，
类型：发明
国别省市：美国,US
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